生物化学经典实验酵母RNA的提取与鉴定省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

酵母RNA提取与判定 第1页实验目实验目 v掌握稀碱法分离酵母掌握稀碱法分离酵母RNA原理与操作过原理与操作过程。程。v了解了解RNA组分并掌握定性判定详细方法。组分并掌握定性判定详细方法。第2页试验原理试验原理 v因为因为因为因为RNARNA起源和种类很多，因而提取制备方法也起源和种类很多，因而提取制备方法也起源和种类很多，因而提取制备方法也起源和种类很多，因而提取制备方法也各异，普通有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。各异，普通有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。各异，普通有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。各异，普通有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。苯酚法是试验室最惯用。组织匀浆用苯酚处理并苯酚法是试验室最惯用。组织匀浆用苯酚处理并苯酚法是试验室最惯用。组织匀浆用苯酚处理并苯酚法是试验室最惯用。组织匀浆用苯酚处理并离心后，离心后，离心后，离心后，RNARNA即溶于上层被苯酚饱和水相中，即溶于上层被苯酚饱和水相中，即溶于上层被苯酚饱和水相中，即溶于上层被苯酚饱和水相中，DNADNA和蛋白质则留在苯酚层中，向水层加入乙醇和蛋白质则留在苯酚层中，向水层加入乙醇和蛋白质则留在苯酚层中，向水层加入乙醇和蛋白质则留在苯酚层中，向水层加入乙醇后，后，后，后，RNARNA即以白色絮状沉淀析出。即以白色絮状沉淀析出。即以白色絮状沉淀析出。即以白色絮状沉淀析出。此法能很好地除去此法能很好地除去此法能很好地除去此法能很好地除去DNADNA和蛋白质，提取和蛋白质，提取和蛋白质，提取和蛋白质，提取RNARNA含有含有含有含有生物活性。生物活性。生物活性。生物活性。第3页试验原理试验原理 v酵母细胞富含核酸，且核酸主要是酵母细胞富含核酸，且核酸主要是酵母细胞富含核酸，且核酸主要是酵母细胞富含核酸，且核酸主要是RNARNA，含量为，含量为，含量为，含量为干菌体干菌体干菌体干菌体2.67%10.0%2.67%10.0%，而，而，而，而DNADNA含量较少，仅为含量较少，仅为含量较少，仅为含量较少，仅为0.03%0.516%,0.03%0.516%,为此提取为此提取为此提取为此提取RNARNA多以酵母为原料。多以酵母为原料。多以酵母为原料。多以酵母为原料。v工业上制备工业上制备工业上制备工业上制备RNARNA多项选择取低成本、适于大规模多项选择取低成本、适于大规模多项选择取低成本、适于大规模多项选择取低成本、适于大规模操作稀碱法或浓盐法。这两种方法所提取核酸均操作稀碱法或浓盐法。这两种方法所提取核酸均操作稀碱法或浓盐法。这两种方法所提取核酸均操作稀碱法或浓盐法。这两种方法所提取核酸均为变性为变性为变性为变性RNARNA，主要用作制备单核苷酸原料，其工，主要用作制备单核苷酸原料，其工，主要用作制备单核苷酸原料，其工，主要用作制备单核苷酸原料，其工艺比较简单。艺比较简单。艺比较简单。艺比较简单。第4页稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后上清液用乙然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后上清液用乙然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后上清液用乙然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后上清液用乙醇沉淀醇沉淀醇沉淀醇沉淀RNARNA或调或调或调或调pH2.5pH2.5利用等电点沉淀。提取利用等电点沉淀。提取利用等电点沉淀。提取利用等电点沉淀。提取RNARNA有不一样程度降解。有不一样程度降解。有不一样程度降解。有不一样程度降解。浓盐法是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改浓盐法是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改浓盐法是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改浓盐法是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改变细胞壁通透性，使核酸从细胞内释放出来。变细胞壁通透性，使核酸从细胞内释放出来。变细胞壁通透性，使核酸从细胞内释放出来。变细胞壁通透性，使核酸从细胞内释放出来。试验原理试验原理 第5页vRNARNA含有核糖、嘌呤碱含有核糖、嘌呤碱含有核糖、嘌呤碱含有核糖、嘌呤碱/嘧啶碱和磷酸各组分。嘧啶碱和磷酸各组分。嘧啶碱和磷酸各组分。嘧啶碱和磷酸各组分。RNARNA在酸性条件下，即发生降解，形成核糖继而在酸性条件下，即发生降解，形成核糖继而在酸性条件下，即发生降解，形成核糖继而在酸性条件下，即发生降解，形成核糖继而转变为糠醛，后者与地衣酚（转变为糠醛，后者与地衣酚（转变为糠醛，后者与地衣酚（转变为糠醛，后者与地衣酚（3 3，5-5-二羟基甲苯）二羟基甲苯）二羟基甲苯）二羟基甲苯）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氧化铜作反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氧化铜作反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氧化铜作反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氧化铜作催化剂。催化剂。催化剂。催化剂。第6页v本试验采取稀碱，既可加速细胞破裂，又可增大本试验采取稀碱，既可加速细胞破裂，又可增大本试验采取稀碱，既可加速细胞破裂，又可增大本试验采取稀碱，既可加速细胞破裂，又可增大 RNARNA溶解度。当碱被中和后，可用乙醇将溶解度。当碱被中和后，可用乙醇将溶解度。当碱被中和后，可用乙醇将溶解度。当碱被中和后，可用乙醇将RNARNA沉沉沉沉淀，此为淀，此为淀，此为淀，此为 RNARNA粗品。粗品。粗品。粗品。v样品中少许脱氧核糖核酸样品中少许脱氧核糖核酸样品中少许脱氧核糖核酸样品中少许脱氧核糖核酸(DNA)(DNA)存在对判定无干存在对判定无干存在对判定无干存在对判定无干扰，蛋白质、粘多糖可干扰判定。扰，蛋白质、粘多糖可干扰判定。扰，蛋白质、粘多糖可干扰判定。扰，蛋白质、粘多糖可干扰判定。第7页试剂配制试剂配制v地衣酚地衣酚地衣酚地衣酚(苔黑酚苔黑酚苔黑酚苔黑酚)三氯化铁试剂三氯化铁试剂三氯化铁试剂三氯化铁试剂 将将将将100mg100mg苔黑酚溶于苔黑酚溶于苔黑酚溶于苔黑酚溶于100ml100ml浓盐酸中，再加浓盐酸中，再加浓盐酸中，再加浓盐酸中，再加入入入入100mgFeCl100mgFeCl3 36H6H2 2O(O(或等量或等量或等量或等量CuO)CuO)。此液需临。此液需临。此液需临。此液需临用时配制。用时配制。用时配制。用时配制。第8页试验步骤试验步骤 1 1、酵母、酵母、酵母、酵母RNARNA提取提取提取提取 称称称称5g5g干酵母粉于干酵母粉于干酵母粉于干酵母粉于150 ml150 ml三角烧瓶中，加三角烧瓶中，加三角烧瓶中，加三角烧瓶中，加50ml 50ml 0.20.2 NaOHNaOH，沸水浴中搅拌提取，沸水浴中搅拌提取，沸水浴中搅拌提取，沸水浴中搅拌提取30 min30 min。冷却。冷却。冷却。冷却后滴加乙酸使其略偏酸性后滴加乙酸使其略偏酸性后滴加乙酸使其略偏酸性后滴加乙酸使其略偏酸性(pH56)(pH56)。离心离心离心离心(4000 r(4000 rminmin，15 min)15 min)，去除沉淀。，去除沉淀。，去除沉淀。，去除沉淀。向上清液中加入向上清液中加入向上清液中加入向上清液中加入30 ml 9530 ml 95乙醇，稍搅拌后静置。乙醇，稍搅拌后静置。乙醇，稍搅拌后静置。乙醇，稍搅拌后静置。待完全沉淀后离心待完全沉淀后离心待完全沉淀后离心待完全沉淀后离心(4000 r(4000 rminmin，15 min)15 min)，去，去，去，去上清液。沉淀加上清液。沉淀加上清液。沉淀加上清液。沉淀加10 ml 9510 ml 95乙醇，搅拌后再次离乙醇，搅拌后再次离乙醇，搅拌后再次离乙醇，搅拌后再次离心。沉淀再依次用心。沉淀再依次用心。沉淀再依次用心。沉淀再依次用10 ml10 ml无水乙醇、乙醚无水乙醇、乙醚无水乙醇、乙醚无水乙醇、乙醚(2)(2)洗洗洗洗涤涤涤涤,得得得得RNARNA粗品。粗品。粗品。粗品。第9页2RNA判定判定 取取取取沉沉沉沉淀淀淀淀约约约约0.2 0.2 g g，加加加加2 2 ml ml 1010HH2 2SOSO4 4沸沸沸沸水水水水浴浴浴浴中中中中加加加加热热热热2 2 minmin加加加加1.5 1.5 mlml地地地地衣衣衣衣酚酚酚酚试试试试剂剂剂剂沸沸沸沸水水水水浴浴浴浴中中中中加加加加热热热热观察颜色改变。观察颜色改变。观察颜色改变。观察颜色改变。试验步骤试验步骤 第10页注意事项注意事项v稀碱法提取稀碱法提取稀碱法提取稀碱法提取RNARNA为变性为变性为变性为变性RNARNA，可用于，可用于，可用于，可用于RNARNA组分组分组分组分判定及单核苷酸制备，不能作为判定及单核苷酸制备，不能作为判定及单核苷酸制备，不能作为判定及单核苷酸制备，不能作为RNARNA生物活性生物活性生物活性生物活性试验材料。试验材料。试验材料。试验材料。v利用等电点控制利用等电点控制利用等电点控制利用等电点控制RNARNA析出时，应严格控制析出时，应严格控制析出时，应严格控制析出时，应严格控制pHpH。v地衣酚反应特异性较差，凡戊糖都有此反应。地衣酚反应特异性较差，凡戊糖都有此反应。地衣酚反应特异性较差，凡戊糖都有此反应。地衣酚反应特异性较差，凡戊糖都有此反应。所以地衣酚试验不能作为所以地衣酚试验不能作为所以地衣酚试验不能作为所以地衣酚试验不能作为RNARNA与与与与DNADNA判别依据。判别依据。判别依据。判别依据。第11页