土壤中分解尿素细菌的分离与计数知识清单.doc

第2课 土壤中分解尿素细菌的分离与计数 知识清单
一、研究思路
1．筛选菌株
(1)实验室中微生物筛选的原理
人为提供有利于________________生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时________或________其他微生物生长。
(2)选择培养基
在微生物学中，将允许__________种类的微生物生长，同时________或________其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。
(3)分离分解尿素的细菌的选择培养基
①在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是____________，提供氮源的是________，琼脂的作用是凝固剂。
②该培养基对微生物具有选择作用。其选择机制是________________________________才能在该培养基上生长。
③土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们体内能合成________，将尿素分解的反应式是________________________________________________________。
Taq细菌能忍受93℃左右的高温，是在美国黄石国家公园的一个热泉中发现的，这说明，在寻找目的菌株时，要根据____________________________________________。
2．统计菌落数目的方法
(1)稀释涂布平板法(也叫活菌计数法)
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的____________，通过统计平板上的________，就能推测出样品中大约含有多少活菌。______________是成功地统计菌落数目的关键。
②操作
第一，设置__________组，增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择________稀释度的菌液，分别取0.1 mL接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布整个平板表面，放在适宜的温度下培养并计算菌落数。为使结果接近真实值，可将同一稀释度涂布到三个或三个以上的平板上，培养并计算出__________。
第二，为了保证结果准确，一般选择菌落数在________的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。
③计算公式：每克样品中的菌株数＝×M，其中C代表___________________________，V代表________________________________(mL)，M代表____________。
(2)设置重复和对照
①设置重复：培养过程中应设置重复组，同一稀释度下应涂布________个平板，才能增强实验的说服力与准确性。
②设置对照：实验中应设置对照，主要目的是排除________________________对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。如__________对照组，观察培养物中是否有杂菌污染；设置________培养基，观察选择培养基是否具有________作用。
二、实验设计
实验步骤
1．土壤取样：从肥沃、湿润的土壤中，用无菌小铁铲铲去表层土3 cm左右，迅速取土壤并装入____________密封或事先准备好的________中。
2．制备培养基：①制备________________培养基作为对照组，尿素为唯一氮源的培养基作为________，用来判断选择培养基是否具有____________。
②放宽稀释范围，如稀释倍数为103～107范围内的要分别涂布，而每个稀释度下需要______个选择培养基、________个牛肉膏蛋白胨培养基，因此需要15个选择培养基和5个牛肉膏蛋白胨培养基。
③两种培养基应各有一个作为________对照，此外还需准备8个灭菌的试管和1个灭菌的移液管。
3．样品的稀释与涂布平板：参考下面的实验流程示意图，将10 g土样加入盛有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中(锥形瓶体积为250 mL)，充分摇匀，吸取上清液1 mL，转移至盛有________ mL生理盐水的无菌大试管依次等比稀释至107稀释度，并按照由107～103稀释度的顺序分别吸取______mL进行平板涂布操作。按照浓度从_____到______的顺序涂布平板，不必更换移液管。
说明：图中的1、2、3平板是____________，4为____________________作对照，判断选择培养基是否具筛选作用，还有两个空白对照，即不涂布稀释后菌液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，验证培养基中是否____________。
4．将涂布好的培养皿放在30℃温度下培养，及时观察和记录。
5．挑选选择培养基上不同形态的菌落接入含____________培养基的斜面中，观察能否产生颜色反应。
6．细菌的计数
当菌落数目稳定时，选取菌落数在________的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出____________，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。同时仔细观察所分离到的菌落，并记录菌落特征。
7．统计表格

注：一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间)，____________表现出________的菌落特征。
三、操作提示
1．取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都要________。
2．应在________旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入________中，塞好棉塞。
3．在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在________旁操作。
4．实验时要对________做好标记。注明________________________________________等。
5．为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当________________。
四、结果分析与评价

五、课题延伸
在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的________将尿素分解成了________。氨会使培养基的碱性增强，________升高。因此，我们可以通过检测培养基____________来判断该化学反应是否发生。
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入________指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将________，这样，我们就可以准确地鉴定该种细菌能够分解尿素。

知识清单
一、1.(1)目的菌株　抑制　阻止　(2)特定　抑制　阻止
(3)①葡萄糖　尿素　②只有能够以尿素作为氮源的微生物　③脲酶　CO(NH2)2＋H2OCO2＋2NH3　它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找
2．(1)①一个活菌　菌落数　恰当的稀释度 ②重复 三个　菌落平均数　30～300　某一稀释度下平板上生长的平均菌落数　涂布平板时所用的稀释液的体积　稀释倍数　(2)①至少3　②实验组中非测试因素　空白　完全　筛选
二、1.(1)无菌信封　烧杯　(2)①牛肉膏蛋白胨　实验组
选择作用　②3　1　③空白　(3)9　0.1　低 高 选择培养基 牛肉膏蛋白胨培养基　含有杂菌　(5)酚红指示剂　(6)30～300　平均值　(7)同种微生物　稳定
三、1.灭菌　2.火焰　锥形瓶　3.火焰　4.培养皿　培养基类型、培养时间、稀释度、培养物　5.事先规划时间
四、无　偏高　其他氮源　大于　30～300　接近
五、脲酶　氨　pH　pH的变化　酚红　变红

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