DB 5304_T 001-2019草莓脱毒瓶苗生产技术规范-(高清正版).pdf
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1、ICS 65.020.20 B 39 DB5304 玉溪市地方标准 DB 5304/T 0012019 DG5304/T 001-2015 草莓脱毒瓶苗生产技术规范 2019 11 25 发布 2020 02 24 实施 玉溪市市场监督管理局 发 布 前 言 本标准按照GB/T 1.12009标准化工作导则 第1部分:标准的结构和编写的规定起草。本标准的附录 A 为资料性附录。本标准由玉溪市农业农村局归口。本标准起草单位:玉溪市农业科学院。本标准主要起草人:张军云、张钟、李晓亮、王文智、杨世先、张建康、张翠萍、陈桂芬、段永华、龚跃华、邓成忠、廖凯。草莓脱毒瓶苗生产技术规范 1 范围 本标准规定
2、了草莓脱毒瓶苗生产的术语和定义、组培工厂的设计要求和所需仪器设备及化学试剂、培养基的配制、消毒灭菌操作、接种操作、培养室操作、组培苗生产流程和脱毒瓶苗出苗标准等。本标准适用于玉溪市草莓脱毒瓶苗生产。2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。2.1 植物组培 植物组织培养的简称,在无菌条件下,将离体的植物器官(如根、茎、叶、花、果实、种子等)、组织(如形成层、胚乳、皮层等)、细胞(体细胞和生殖细胞)或原生质体等,培养在人工配制的培养基上,在一定的光照和温度条件下,使之生长、分化并发育成完整小植株的培养技术。2.2 草莓茎尖脱毒组培技术 根据植物病毒在植物体内分布的不均性,越接近茎尖生长点(约
3、0.11 毫米区域),病毒浓度越稀或接近无病毒的原理,采用草莓茎尖处较小的生长点通过离体植物组织培养达到脱除植物病毒的技术。2.3 组培苗(瓶苗)经植物组织培养获得的根茎叶齐全的瓶装生根苗。2.4 组培室 采用植物组织培养技术,生产植物组培苗的车间。2.5 外植体 指用于植物组织培养的植物体或一部分器官、组织、细胞及细胞器。2.6 植物激素 调节植物生长发育的物质,对植物的生长、发育、衰老、休眠、抗逆性具有极其重要的作用,组织培养常用的植物激素有生长素、细胞分裂素。2.7 培养基 在植物组织培养过程中,根据不同植物营养所需求,由人工配制的提供培养材料生长所必需的营养元素和某些植物生长物质的基质
4、。2.8 培养材料 生长在培养容器中的培养基上的无菌植物材料。2.9 接种 将灭菌后的外植体或培养材料在无菌条件下接入培养容器内培养基中的过程。2.10 初代培养 指将灭菌后的外植体接种在无菌培养基中获得无菌材料和无性繁殖系前的最初几代培养。2.11 诱导培养 将灭菌后的外植体或培养材料接种到培养基中进行培养使其生长发育的过程。2.12 继代培养 培养过程中将培养材料周期性地分株、分割、剪截等操作后转接入新鲜培养基中继续培养的过程。2.13 增殖培养 继代培养材料产生出不定芽或新的组培苗的过程。2.14 培养代数 同一培养材料经继代培养的次数。2.15 繁殖倍数 一个培养周期内不定芽增殖倍数,
5、即培养一个周期后增殖的不定芽数/接种时的不定芽数。2.16 生根培养 把不定芽转移到生根诱导培养基中诱导生根,形成完整植株的过程。2.17 组培室 进行植物组织培养技术研究和组培苗生产的场所,包括洗涤室,培养基配制室,灭菌室,接种室和培养室等部分。2.18 洗涤室 洗涤各种玻璃器皿、培养瓶和各种用具以及进行植物材料预处理的场所。2.19 培养基配制室 配制化学试剂、培养基母液、培养基以及分装培养基和蒸馏水等的场所。2.20 灭菌室 进行培养基、无菌水和器械等高压灭菌的场所。2.21 接种室 接种室也称无菌操作室,是外植体的灭菌、培养材料的接种、转移、继代增殖、生根等无菌操作工作的场所。2.22
6、 培养室 培养材料和组培苗在人工控制温度、相对湿度和光照等条件下培养和生长的场所。3 组培工厂的设计要求、所需仪器设备及化学试剂 3.1 设计要求 3.1.1 组培工厂应建在排水设施良好,常年主风向的上风区。应远离各种污染源(如粉尘大的工厂、微生物工厂和繁忙交通干道),周边环境应干燥、安静、通风透光、空气清新。3.1.2 组培工厂设计包括组培车间:洗涤室、培养基配制室、灭菌室、接种室、培养室、办公室等。3.1.3 新建组培工厂地基应高出地面 30 厘米以上,楼顶不应有渗漏;若建两层或三层,洗涤室、培养基配制室、灭菌室宜安排在楼下,接种室、培养室应防潮、隔热保温,宜安排在二楼、三楼。3.1.4
7、利用办公室、仓库等旧房进行改造的组培工厂,应合理安排,做到杜绝污染,方便工作,节省能源,使用安全。3.1.5 组培工厂各分区要布局合理,应根据生产工艺流程,把各部分安排成一条连续、有序和通畅的生产流水线。3.2 生产设备 3.2.1 洗涤设备 工厂化生产可选用自动或半自动洗瓶机或人工洗涤,配洗涤室水槽、塑料盆、塑料桶、塑料箱等。3.2.2 灭菌设备 高压蒸汽灭菌锅(大型卧式、中型立式、小型手提式)、器械消毒器、紫外灯、烘干箱、臭氧发生器、除湿器等。3.2.3 接种设备及工具 无菌超净工作台、镊子、剪刀、解剖刀、手术刀、酒精灯等。3.2.4 培养设备 培养容器(三角瓶、罐头瓶、专制塑料瓶、试管等
8、)、培养架、空调、除湿机、光照培养箱等。3.2.5 实验设备 冰箱、蒸馏水器、电子天平、pH 试纸、温湿度表、盛装器皿(烧杯、试剂瓶等)、计量器皿(量筒、容量瓶、移液管等)以及其他实验室常用器具等。3.2.6 脱毒设备 体视显微镜、解剖镜、高倍显微镜、电热恒温水浴锅、光照培养箱等,有条件的还可购置显微照相设备、测微尺等。3.3 常用化学试剂 组培中常用的无机盐类、有机物类、植物生长物质、消毒剂等参见附录 A。4 培养基的配制 4.1 MS 基本培养基母液的配制 表1 MS 基本培养基的配制比例表 编 号 母液 成 分 规定量(mg/L)扩大 倍数 称取量(mg)母液 体积(ml)配制1升培养基
9、吸取量定容 1 大量元素 硝酸钾 KNO3 1900 10 19000 1000 100 硝酸铵 NH4NO3 1650 10 16500 硫酸镁 MgSO47H2O 370 10 3700 磷酸二氢钾 KH2PO4 170 10 1700 2 氯化钙 CaCl22H2O 440 10 4400 1000 100 3 微量元素 硫酸锰 MnSO44H2O 22.3 100 2230 1000 10 硫酸锌 ZnSO47H2O 8.6 100 860 硼酸 H3BO3 6.2 100 620 碘化钾 KI 0.83 100 83 钼酸钠 Na2MoO47H2O 0.25 100 25 硫酸铜 C
10、uSO4.5H2O 0.025 100 2.5 氯化钴 CoCL2.6H2O 0.025 100 2.5 4 铁盐 乙二胺四乙酸二钠 Na2-EDTA 37.3 100 3730 1000 10 硫酸亚铁 FeSO4.7H2O 27.8 100 2780 5 有机物 甘氨酸 C2H5NO2 2.0 100 100 500 10 盐酸吡哆醇 VB6 0.5 100 25 盐酸硫铵素 VB1 0.1 100 5 烟酸 C6H5NO2 0.5 100 25 6 肌醇 C6H12O6 100 100 5000 500 10 4.2 植物激素的母液配制 细胞分裂素 6-BA:先用少量 0.1mol/L
11、的盐酸(HCl)溶解,然后加蒸馏水定容,配成浓度为 0.20.4 mg/ml 的母液。生长素 NAA:先用少量 0.1mol/L 的 KOH 或 NaOH 溶解,然后加蒸馏水定容,配成浓度为 0.01 mg/ml 的母液。母液保存于 4左右的冰箱内,保存不超过 15 天;母液容器上应贴好标签,注明名称、配制日期,发现标签不明或母液中有沉淀、浑浊或变色现象应停止使用。4.3 培养基配制 4.3.1 按配制培养基的量,称取所需要量的蔗糖、琼脂,量取所需量的基本培养基母液和植物激素母液。4.3.2 定容:加水定容,并充分搅拌均匀。4.3.3 调节 pH:用 pH 计或 pH 试纸测 pH 值,用 0
12、.1 mol/L 的 HCl 或 0.1 mol/L 的 NaOH 调节 pH 至要求值 5.86.0。4.3.4 分装:按照 30 ml/瓶进行分装。4.3.5 封口:盖好瓶盖,瓶盖外封一层报纸或白布,并用绳扎紧报纸或白布。5 消毒灭菌操作 5.1 高压蒸汽灭菌锅使用 5.1.1 组培中主要采用高压蒸汽灭菌器进行湿热灭菌,高压灭菌器适用于培养基(不耐高温的成分除外)、无菌水、玻璃器皿、金属器械等,以及污染瓶的灭菌处理。5.1.2 应严格按使用说明书操作各种类型的高压灭菌器。5.2 培养基灭菌 5.2.1 将封好口的培养基整齐放入高压灭菌锅内,盖紧盖,打开放气阀,加热排尽冷空气,关上放气阀,继
13、续加热待压力表指针达到 1.1 kg/cm2 时开始计时,通常在压力 1.1 kg/cm21.2 kg/cm2 下,温度 121下灭菌 2030 分钟,时间到关闭电源自然冷却到压力表为 0 方可取出培养基。5.2.2 灭菌后的培养基应冷却,待完全凝固后再用。5.2.3 已灭菌的培养基不得与未灭菌培养基混放;灭菌后的培养基应注明培养基编号及配制日期。按培养基种类和配制先后分门别类储存于培养基储藏室内。为保证培养基质量,宜将配制好的培养基放置 5 天左右再用,且贮存时间不应超过一个月。5.3 其它材料灭菌 无菌水、玻璃器皿、接种器灭菌方法同培养基灭菌。接种器械用棉布或纸包好。5.4 灼烧灭菌 5.
14、4.1 灼烧灭菌可采用接种用电热灭菌器或用酒精灯灼烧灭菌。5.4.2 用于超净工作台操作的镊子、手术刀、解剖刀等器械采用灼烧灭菌。5.5 擦拭、喷雾灭菌 5.5.1 物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如超净工作台台面、墙面、双手、植物材料表面等。5.5.2 擦拭、喷雾灭菌可用 75%的酒精。5.6 紫外线、臭氧灭菌 5.6.1 在接种室、培养室等房间定期用紫外灯、臭氧灭菌。5.6.2 灭菌一般为 30 分钟。5.7 熏蒸灭菌 5.7.1 接种室和培养室定期(一般 1 年 1 次2 次)用高锰酸钾及甲醛混合熏蒸。5.7.2 熏蒸时,房间关闭紧密,用甲醛(10 ml/m)和高锰酸钾(KMnO4,
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