土壤中分解尿素的细菌的分离与计数导学案.doc

土壤中分解尿素的细菌的分离与激素

1、尿素[CO(NH2)2]——重要的农业氮肥。只能被土壤中细菌分解为NH3才能被植物吸收利用。
2、 CO(NH2)2 + H2O 细菌脲酶 CO2 +2NH3
一、研究思路
（一）筛选菌株
1、实例----耐高温DNA聚合酶的寻找
美国科学家布鲁克（1966年）--在美国黄石公园的一个热泉中发现耐热细菌。这说明寻找菌株要到期相应的 中寻找。
2、实验室中微生物的筛选原理
人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用 选择培养分离 的方法，或抑制使大多数微生物不能生长，或造成有利于该菌生长的环境，经过一定时间培养后使该菌在群落中的数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯培养分离。
思考：
1、该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？
碳源：葡萄糖、尿素 氮源：
2、此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？
能。只有产生脲酶的细菌才能利用 作为氮源而生存。

3、筛选菌株的培养基
KH2PO4 1.4g
NaHPO4 2.1g
MgSO4 H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。
4、选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
思考：
1、1个菌落 1个活菌。
2、统计的菌落数 实际活的细菌数。
3、用稀释涂布平板法一定要重复实验，一般
至少要涂布3个平板。
4、重复实验结果中小于30菌落的不用。

（二）、统计菌落数目：
1、活体计数法----稀释涂布平板法
（1）操作方法：稀释涂布平板 → 统计菌落数。
（2）原理：1个菌落→1个活菌。
（3）统计原则
①、选 30∼300 个菌落的平板统计。
②、每个稀释度取3个平板取其平均值。
（4）统计结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目 ，因此统计结果一般用 表示。
每克样品中的菌株数= 。
C:某一稀释度下平板上生长的平均菌落数； V:所用稀释液的体积； M:稀释倍数。
2、显微镜直接计数
（三）设置对照
1、设置对照的目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
2、对照实验是指除了 被测试 的条件外，其他条件都 相同 的实验。满足该条件的称为 对照组，未满足该条件的称为 实验 组。
菌落计数
配制土壤溶液
系列稀释
涂布平板与培养
实验组：
对照组：设置对照 ---- 同等条件下，培养空白培养基。
四、实验设计
（一）土壤取样 
1、土壤是天然培养基 ---- 其微生物数量 、种类 。
2、土壤取样：
（1）取样的位置：土壤中70∼90％是细菌。在富含有机质的土壤层的3∼8cm处中分布着绝大多数的细菌。
（2）取样要求：铲去表层土。
（1）、测细菌数：一般用104、105、106稀释液。
（二）样品稀释 （2）、测放线菌：一般用103、104、105稀释液。 原则：确保平板上的菌落数在 之间。
（3）、测真菌数：一般用102、103、104稀释液。
1、接种：用适当的稀释液作涂布平板
2、培养：细 菌：30∼37℃，1∼2d；
（三）微生物的培养与观察 放线菌: 25∼28℃, 5∼7d；
霉 菌: 25∼28℃, 3∼4d。
3、观察：
a. 每24h统计一次菌落数目。 原因：不同种类的微生物，往往需不同的培养温度和培养时间，每隔24h统计1次菌落数目，选取菌落数目稳定时记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
b. 以“稳定菌落”为观察对象。原因：不同种类的细菌形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一度的特征，菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。
（四）鉴定 酚红鉴别培养基：鉴定分解尿素的细菌。
原理：脲酶催化尿素分解成氨→ 培养基碱性增强→ 酚红变红→ 结论：该细菌能分解尿素。
注意：
1、在一定的培养条件下（相同的培养基、温度及培养时间），同种微生物表现出相同而稳定的菌落特征。
2、关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。
五、实验的具体操作
（一）、无菌操作
1、土壤取样
从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。
取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。
2、制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。
注 意
①、为了保证结果准确，一般选择菌落数在30——300的平板上进行计数。
②、为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。
③、统计的菌落往往比活菌的实际数目低。这是因为两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。
④、涂布平板法所选择倒平板的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度倒平板所出现的平均菌落数在50个左右为最好。

3、样品的稀释：

（1）、应在火焰旁称取土壤10g。将称好的土样倒入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。
（2）、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。
（3）、分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原因是不同微生物在土壤中含量不同，其目的是保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。
（4）、如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。
（二）、做好标记
1、实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。
2、装系列稀释菌的试管在试管架上最好由低到高放置。
（三）、制定计划
六、结果分析与评价
1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。
2.提示：选择每个平板上长有30——300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。
注意：测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝鉴别性培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。

例1：土壤中的细菌能分解尿素，是因为它们能合成一种(　　)
A．尿素酶 B．脲酶 C．蛋白酶 D．肽酶
例2：在培养基中加入尿素(惟一氮源)，以分离出能分解尿素的细菌，这种加入尿素的培养基在功能上属于(　　)
A．选择培养基 B．固体培养基 C．液体培养基 D．半固体培养基
例3：实验测定链霉素对3种细菌的抗生素效应，用3种细菌在事先准备好的琼脂平板上画3条等长的平行线(3条线均与图中的链霉素带接触)，将平板置于37 ℃条件下恒温培养3天，结果如图所示。从实验结果分析，以下叙述不正确的是(　　)
A．链霉素能阻止结核菌的生长
B．链霉素对结核菌比对霍乱菌更有效
C．链霉素对结核菌比对伤寒菌更有效
D．链霉素可以用于治疗伤寒病人
例4：测定土壤中细菌数量一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养，而测定真菌的数量一般选用102、103和104倍稀释，其原因是(　　)
A．细菌个体小，真菌个体大 B．细菌易稀释，真菌不易稀释
C．细菌在土壤中数量比真菌多 D．随机的，没有原因
例5：用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是(　　)
A．未接种的选择培养基 B．未接种的牛肉膏蛋白胨培养基
C．接种了的牛肉膏蛋白胨培养基 D．接种了的选择培养基
例6：通常用来作为菌种鉴定的重要依据是(　　)
A．菌落 B．细菌形态 C．细菌体积 D．细菌结构
例7：下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是(　　)
A．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水
B．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、琼脂、水
C．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、尿素、琼脂、水
D．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水
例8：在涂布平板操作时错误的是(　　)
A．将涂布器在酒精灯火焰上灼烧，直到烧红 B．取少量菌液滴加在培养基表面
C．将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃待酒精燃尽后，冷却8 s～10 s再用
D．涂布时可转动培养皿，使涂布均匀
例9：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养能分解尿素的细菌后，指示剂的颜色是(　　)
A．蓝色 B．红色 C．黑色 D．棕色
例10：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时又能抑制或者阻止其他种类微生物生长的培养基称做(　　)
A．鉴别培养基 B．加富培养基 C．选择培养基 D．基础培养基
例11：分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是(　　)
①加尿素　②不加尿素　③加琼脂　④不加琼脂　⑤加葡萄糖　⑥不加葡萄糖　⑦加硝酸盐　⑧不加硝酸盐
A．①③⑤⑦ B．②④⑥⑧ C．①③⑤⑧ D．①④⑥⑦
例12：在寻找目的菌株时，要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找，下列不属于厌氧细菌生存环境的是(　　)
A．土壤深层 B．人或动物体内寄生 C．真空 D．池塘淤泥
例13：下列是关于检测土壤中细菌总数实验操作的叙述，其中错误的是(　　)
A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板
B．取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上
C．将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48小时
D．确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数
例14：可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是(　　)
A．以尿素为惟一氮源的培养基中加入二苯胺试剂 B．以尿素为惟一氮源的培养基中加入酚红指示剂
C．以尿素为惟一氮源的培养基中加入苏丹Ⅲ试剂 D．以尿素为惟一氮源的培养基中加入双缩脲试剂
例15：在做土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验时，甲组实验用氮源只含尿素的培养基，乙组实验用氮源除尿素外还含硝酸盐的培养基，其他成分都相同，在相同条件下操作，培养与观察，则乙组实验属于(　　)
A．空白对照 B．标准对照 C．相互对照 D．条件对照

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