微生物学检验--操作流程及评分标准.doc

显微镜的使用操作流程及评分标准
项目
内容
分值
扣分标准
扣分
目的
掌握显微镜的使用方法及注意事项

用物
准备
光学显微镜、载玻片、擦镜纸、香柏油、脱油剂

素质要求
让学生能够熟练使用显微镜

操
作
步
骤
1。安放：把显微镜放在自己前面略偏左的桌面上，这样便于用左眼观察物像,用右眼看着画图。安放时镜筒向前，镜臂向后. 
2.对光：转动转换器，使低倍物镜正对通光孔，并使物镜前端与载物台有两厘米左右的距离.然后把反光镜对着光源，但是反光镜不能直接对着太阳。只要视野的光亮程度合适,光就对好了。 
3。观察：对好光后,把显微镜玻片标本放在载物台上，并使玻片上的标本对着通光孔的中心,再用压片夹夹住。然后慢慢地转动调焦螺旋,直到接近玻片为止。接着，用左眼向目镜内注视，同时反方向转动调焦螺旋,直到看清物像为止。
4.再放大：选好一个放大目标，再把要放大的部分移到视野正中心，如果物像不清楚，再转动调焦螺旋。如果还观察不清楚，就必须换用高倍物镜。用高倍物镜观察时，高倍物镜顶端离玻片很近,稍不小心,镜头就会压到玻片，所以要特别小心. 
5。在显微镜里看到的物像是倒像，因此，要使物像向上移动，就要向下移动玻片；要使物像向左移动,就要向右移动玻片. 

注
意
事
项
1.先用低倍镜观察，用低倍镜能看清的,就不再用高倍镜。
2。必须保护好镜头。
3。载物台要保持清洁干燥. 
4。转动调焦螺旋不要用力过猛,以防损伤机件。 
5.取用显微镜要轻拿轻放，要用右手握镜臂,左手托镜座。 
6。使用完毕，要把显微镜外表擦干净，并把镜筒旋下至最低处.最后把显微镜放入镜箱,送回原处保存。

细菌的形态学检验操作流程及评分标准
项目
内容
分值
扣分标准
扣分
目的
掌握革兰染色的基本原理和操作方法

用物
准备
革兰染色液、生理盐水、载玻片、接种环、酒精灯、显微镜、香柏油、蜡笔、擦镜纸、脱油剂

素质要求
能够熟练对细菌标本进行染色，观察结果，对细菌进行分类

操
作
步
骤
（1）涂片：取清洁无油迹的载玻片1张，用蜡笔划线将其分成左右两格.用接种环先挑取生理盐水1～2环于载玻片每格中央，再分别挑取大肠杆菌和葡萄球菌少许菌落与生理盐水研匀，涂成直径约1。5cm的菌膜。
(2）干燥：让涂片自然干燥,也可在酒精灯火焰较远处微微加热烘干,但切勿靠近火焰.
(3）固定：干燥后的标本片在酒精灯火焰上来回通过3次（以钟摆的速度），冷却后染色。固定的目的在于杀死细菌,并使菌膜与玻片牢固粘附，避免染色过程中被水冲洗掉，通过固定还可凝固细胞质，改变细菌对染料的通透性，使细菌易与染料结合而着色.
(4）染色:结晶紫-——卢戈碘液-—-95％乙醇—-——稀释石炭酸复红--—待干、镜检(初染)—--—（媒染)---—（脱色）——-—（复染）

注
意
事
项
1。革兰氏染色成败的关键是酒精脱色时间。 
2.染色过程中勿使染色液干涸。
3。选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，E。coli培养24h。

基础培养基的制备与灭菌操作流程及评分标准
项目
内容
分值
扣分标准
扣分
目的
掌握基础基础培养基的配制流程、灭菌的方法及注意事项

用物
准备
牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂粉、1mol/L NaOH、1mol/LHCl
试管、吸管、平皿、锥形瓶、量筒、吸管、精密PH试纸、天平、滤纸

素质要求
要求熟练操作培养基的配制和灭菌

操
作
步
骤
一、培养基的配制
1。配制溶液 
2.调节pH值 
3。过滤 
4。分装 

二、培养基的灭菌
 1.开盖 
 2。通电
 3。加水     
4。放样     
5。设定温度和时间 

注
意
事
项
1． 调节PH值时，要边滴氢氧化钠边搅拌，不能一次加太多
2． 加热时间控制好,否则培养基会煮糊。
3． 灭菌是要注意将灭菌锅里的空气排干净。
4． 注意灭菌的时间和温度的控制.

细菌的接种培养法操作流程及评分标准
项目
内容
分值
扣分标准
扣分
目的
掌握细菌的接种方法及操作流程

用物
准备
温箱、酒精灯、接种环、接种针、L形玻棒、打火机、记号笔

素质要求
能够熟练操作各种接种方法

操
作
步
骤
（一)平板划线接种法(又称分离培养法） 
烧灼接种环，杀灭环上残留细菌，待冷，从薄膜处取菌作连续平行划线，约占平板表面1/5左右，再次烧灼接种环，等三次平行划线……以同样方法作第四次,第五次划线，将平板表面划完。划线完毕，盖上平皿盖,底面向上，用标签或腊笔注明菌名检验号码,接种者信息等,置37℃孵育培养24小时后观察结果。
（二）斜面培养基接种法  
试管口部于火焰上往返通过2~3次灭菌,将灭菌白金环伸入有菌试管中，取少量细菌，然后移至准备接种的试管中。  
接种方法是自管底向上连续平划线,若以保存菌为目的时可自管底上划一粗直线即可。  
取出接种环，将试管上部再经火焰灭菌，塞好棉塞，接种环灭菌后放回原处。     
（三）半固体培养基穿刺培养法
灭菌穿刺针沾取细菌后,垂直刺入半固体培养基中央直达近管底处，再沿原穿刺线抽出即可。

注
意
事
项
1．选择适合其生长需要的培养基
2．防止污染。培养基和一切用具必须彻底灭菌；操作时必须靠近火焰；操作完毕后，禁止再让培养基接触外界空气。 
3．防止接种器械过热，很容易杀死分离培养的细菌。

细菌的分布操作流程及评分标准
项目
内容
分值
扣分标准
扣分
目的
熟悉细菌在自然界和人体的分布，了解外界因素对细菌的影响

用物
准备
待测水样、泥土、无菌吸管，平皿，无菌生理盐水

素质要求
让学生熟悉细菌在自然界和人体的分布情况

操
作
步
骤
1。空气中细菌的检查
（1）方法：取普通平板（或血平板）1个，选室内或室外的一处空间,在离地面1m左右高度的桌面(或台面）上，打开平板盖，让培养基暴露于空气中，10min之后，迅速盖好盖子，在底部写上标记,放35℃培养18~24h，观察结果。 
（2）结果观察
2．水中细菌检查
（1）方法：
1）用无菌三角烧瓶以无菌的方法采集水样.
2）用无菌吸管吸取1ml水样以无菌技术加入无菌平皿中。
3)趁热（不烫手为宜）,倾注约15ml的普通琼脂，立即在台面上轻轻转动平皿使其混匀.待琼脂凝固后，将其放入35℃,培养18～24h。 
(2）结果观察报告.
3．人体咽喉部细菌检查
（1）方法：
1）采样
持无菌棉拭1根，待受试者张大嘴巴后,迅速伸入对方悬臃垂后的咽喉部，轻轻揩取咽喉壁上的分泌物。
2）接种
以无菌方法用棉签在琼脂平板的一角（1/4处）来回划线，去掉棉拭，然后用接种环在原划线上过2~3下，接着往下划线分离。 
3)培养
写上标记，将平板放35℃，18~24h培养.

注
意
事
项
1.注意无菌操作，防止空气或人体上的细菌污染。
2．倒入的培养基温度大约在45℃左右（热而不烫手为宜)，太热，太冷都不行。

细菌对抗药物敏感试验操作流程及评分标准
项目
内容
分值
扣分标准
扣分
目的
掌握药敏试验的方法、原理、结果判读、临床意义

用物
准备
供试菌种、普通琼脂培养基、药敏纸片、培养起、平皿、镊子、试管、酒精灯、涂布棒

素质要求
要求学生熟练操作纸片扩散法

操
作
步
骤
1． 配制培养基
2。配制菌悬液
3.涂布于琼脂平板的表面
4。室温下干燥3—5分钟
5。贴药敏纸片
6。35℃培养16-18小时
7.测量抑菌圈直径,参照相关标准判读结果.

注
意
事
项
1。培养基的质量
2.药敏纸片的质量,含药量和保存方式
3。接种菌量正确与否是影响结果的重要因素之一，取决于麦氏比浊标准的配制，正确使用和保存
5孵育条件，温度和时间
6抑菌圈测量工具的精度
7质控菌种本身的药敏特性是否合格，有无变异。

糖发酵试验操作流程及评分标准
项目
内容
分值
扣分标准
扣分
目的
熟悉葡萄糖发酵试验的原理和操作方法。

用物
准备
大肠杆菌,糖发酵管

素质要求
熟悉大肠杆菌对葡糖糖的发酵情况。

操
作
步
骤
1. 取两支HL葡萄糖培养基，置沸水中水浴10分钟。
2. 冷却,将待检细菌接种到2支培养基中。
3. 取其中一支加灭菌的液体石蜡，使其与空气隔绝，另一管不加液体石蜡
4. 35℃培养18—24小时，观察结果

注
意
事
项
配制糖发酵管内装的小倒管在接种细菌前应是无气泡存在的，否则不能进行接种

甲基红试验操作流程及评分标准
项目
内容
分值
扣分标准
扣分
目的
熟悉甲基红试验的原理和操作方法。

用物
准备
菌种、葡萄糖蛋白胨培养基，甲基红

素质要求
能利用甲基红试验对大肠杆菌进行鉴定

操
作
步
骤
1. 将待检的细菌接种于葡萄糖蛋白胨水中
2. 35℃培养18—24小时
3. 滴加甲基红试剂
4. 结果：呈红色为阳性，黄色为阴性。

注
意
事
项
1.注意无菌操作
2。注意观察指示剂的变化

病毒的分离培养操作流程及评分标准
项目
内容
分值
扣分标准
扣分
目的
了解鸡胚培养常见的几种接种方法；
掌握鸡胚尿囊腔接种的操作技术。

用物
准备
受精卵、孵卵器，检卵灯,齿钻,磨壳器,钢针,蛋座木架,注射器，2．5％碘酒，70%酒精,镊子，剪刀，封蜡(固体石蜡加 1/4凡士林，溶化）,灭菌培养皿,灭菌盖玻片等。

素质要求
要求能够对不同的病毒通过鸡胚进行培养

操
作
步
骤
一、准备蛋胚
二、接种
1。绒毛尿囊膜接种
将孵育10—12天的蛋胚放在检卵灯上，选择血管较少的地方做一记号,并在记号处的卵壳上磨开一三角形小窗,用小镊子揭去所开小窗处的卵壳，小心地划破壳膜,用针尖刺破气室小孔处的壳膜,用注射器通过窗口的壳膜窗孔滴 0．05— 0．1ml病毒液于绒毛尿囊膜上。涂上半凝固的石蜡，将鸡卵保持人工气室在上方的位置37℃培养，48—96小时观察结果.
2. 尿囊腔接种
将蛋胚在检卵灯上照视,并在绒毛尿囊膜血管较少的地方作记号.用碘酒消毒气室蛋壳，并用钢针在记号处钻一小孔。用带18mm长针头的1ml注射器吸取病毒液，针头刺入孔内，经绒毛尿囊膜入尿囊腔,注入0．1ml病毒液。用石蜡封孔后于37℃孵卵器孵育72小时。
3.羊膜腔接种
将孵育10-11天的蛋胚照视，画出气室范围,并在胚胎最靠近卵壳的一侧做记号.用齿钻在气室顶端磨一三角形,用镊子揭去蛋壳和壳膜，并滴加灭菌液体石蜡一滴，用镊子，刺穿下层壳膜和绒毛尿囊膜没有血管的地方，用26号针头的注射器，刺入羊膜腔内，注入病毒液 0．1ml。将卵壳的小窗封住，于37℃孵卵器内孵育48—72小时.
4.收获

注
意
事
项
防止污染：接种全过程要求无菌操作。为减少污染，要求方法简单、操作迅速 。 
（2）温度要适宜,接种过的鸡胚,要根据所接种的病原体生长增殖所需要的温度，置温箱中孵育。