DB35_T+1621水禽1型甲肝病毒亚型感染诊断技术-(高清版).pdf
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1、ICS 11.220 B 41 DB35 福建省地方标准 DB35/T 16212016 水禽 1 型甲肝病毒亚型感染诊断技术 Diagnostic Protocol for subtype of duck hepatitis A virus type-1 infection in waterfowl 2016-12-30 发布 2017-04-01 实施 福建省质量技术监督局 发 布 目 次 前言.II 1 范围.1 2 疫病概述.1 3 临床诊断.1 4 反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)诊断.2 附录 A(规范性附录)相关试剂的配制.4 附录 B(资料性附录)RT-PCR 检测结果电
2、泳图例.6 附录 C(资料性附录)水禽 1 型甲肝病毒亚型 VP1 基因序列.7 前 言 本标准按照GB/T 1.12009标准化工作导则 第1部分:标准的结构和编写给出的规则起草。本标准由福建省农业科学院提出。本标准由福建省农业厅归口。本标准起草单位:福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心。本标准主要起草人:黄瑜、傅光华、傅秋玲、白泉阳、施少华、程龙飞、万春和、陈红梅、陈珍、朱春华、陈翠腾、刘荣昌、潘飞龙。水禽 1 型甲肝病毒亚型感染诊断技术 1 范围 本标准规定了水禽1型甲肝病毒亚型感染的临床诊断要点及病毒核酸检测的反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)的操作
3、技术规程。本标准适用于水禽1型甲肝病毒亚型感染的临床诊断和实验室诊断。2 疫病概述 水禽1型甲肝病毒亚型感染,俗称水禽胰腺炎,是由不同于致雏鸭典型肝炎(肝脏肿大、出血)的鸭1型甲肝病毒(DHAV-1)的鸭1型甲肝病毒亚型(DHAV-1a)引起雏鸭(鹅)胰腺发黄、出血为特征的新发疫病。该病最早于2011年9月发生于我国福建、浙江两省的雏番鸭群,一年四季均有发生,其发病率和病死率分别为30%43%、60%78%不等。其全基因组序列与经典的肝炎型DHAV-1参考毒株核苷酸序列和氨基酸同源性分别介于93.5%99.6%和97.9%99.6%之间,与经典的肝炎型DHAV-1间的抗原亲缘值(R)为0.62
4、(介于0.320.70间);其特征性剖检病变为胰腺发黄、出血,完全不同于引起典型肝炎的DHAV-1所致的肝脏肿大、出血特征病变,且在易感动物上也存在明显差异,雏番鸭、雏半番鸭和雏鹅对该病较易感、北京樱桃谷雏鸭和雏麻鸭对该病不易感,而经典的肝炎型DHAV-1却反之。3 临床诊断 3.1 临床症状 当雏鸭(鹅)出现以下部分或全部临床症状时,可作为初步诊断的依据:a)采食或(和)饮水量下降;b)表现沉郁或扎堆;c)出现死亡。3.2 剖检病变 当雏鸭(鹅)出现以下肉眼剖检病变时,可作为初步诊断的依据:病死雏鸭(鹅)胰腺发黄或(和)存在散在出血点或(和)出血灶。3.3 初步诊断 当雏鸭(鹅)出现3.1描
5、述的部分或全部临床症状或(和)3.2描述的剖检病变时,可作出初步诊断;确切诊断需通过实验室做进一步检测。4 反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)诊断 4.1 样品采集与处理 尽量采集发病、濒死或病死雏鸭(鹅)的胰腺组织样品,尽快处理,即将采集的组织样品剪碎,与磷酸盐缓冲液(PBS,配制方法见附录A.1)按照体积比1:3的比例制成组织匀浆液,反复冻融3次,8 000 r/min离心30 min,取上清,用于RNA抽提,或置-20 冻存备用。若在6 h以上处理的样品,应先置-20 条件下保存备用,需托运时应确保冷藏或冰冻状态运输。4.2 仪器设备 4.2.1 PCR 仪。4.2.2 高速台式冷冻
6、离心机。4.2.3 微量移液器。4.2.4 组织匀浆器。4.2.5 电泳仪。4.2.6 电泳槽。4.2.7 紫外凝胶成像系统。4.3 试剂 4.3.1 RNA 提取试剂 Trizol。4.3.2 三氯甲烷。4.3.3 异丙醇。4.3.4 焦炭酸二乙酯(DEPC)处理水:配制方法见附录 A.2。4.3.5 75%乙醇:配制方法见附录 A.3。4.3.6 溴化乙锭溶液:配制方法见附录 A.4。4.3.7 1 TAE 缓冲液:配制方法见附录 A.5。4.3.8 1.0%琼脂糖凝胶:配制方法见附录 A.6。4.3.9 DNA 相对分子质量标准物:DL2000。4.3.10 10 加样缓冲液:配制方法见
7、附录 A.7。4.4 引物 根据水禽(鸭、鹅)DHAV-1a VP1基因保守区特征设计特异性引物,上游引物F:5-GGTGATTCCAACCAGTTAGGGGAT-3和下游引物R:5-TTCAATTTCCAGGTTGAGTTCA-3,用于扩增目的条带约700 bp大小的VP1基因片段。上、下游引物的使用浓度均为 20 pmol/L。4.5 病毒 RNA 提取 病毒RNA提取方法如下:a)取 250 L 组织匀浆上清液加入 1.5 mL 灭菌离心管后,加入 750 L RNA 提取试剂 Trizol,充分混匀 15 s,再加入 200 L 预冷的三氯甲烷后,充分倒置混匀,室温静置 10 min。
8、b)4 条件下,12 000 r/min 离心 15 min。取经 DEPC 处理水处理的 1.5 mL 灭菌离心管,小心吸取离心上清液 600 L,加入等体积-20 预冷的异丙醇,反复颠倒混匀。c)4 条件下,12 000 r/min 离心 15 min。轻轻倾倒上清液,加入 800 L 75%乙醇清洗 2 次,倒置于吸水纸上 5 min,室温晾干。d)加入 20 L DEPC 处理水,轻轻混匀溶解离心管壁上核酸 RNA,2 000 r/min 离心 30 s,提取的RNA 应在 2 h 内进行 RT-PCR 扩增或保存于-20 冰箱备用。也可采用市售商品化的等效核酸RNA提取试剂盒,完成核
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