DB15_T 2905-2023羊副流感病毒3型检测技术规范.pdf
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1、 ICS 11.220 CCS B 41 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 29052023 羊副流感病毒 3 型检测技术规范 Technical specification for diagnostic of capine parainfluenza virus type 3 2023-03-10 发布 2023-04-10 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会(SAM/TC 19)归口。本文件起草单位:内蒙古大学、内蒙古蒙微生物科技
2、有限公司、金宇保灵生物药品有限公司、内蒙古自治区动物疫病预防控制中心、内蒙古科技大学包头师范学院、吉林农业科技学院。本文件主要起草人:王炜、马艳华、王镓磊、赵丽霞、杨昱萍、郭宇、韩四娥、郭利、武有志、王岩、萨如拉、高登军、王旭红、胡薇。羊副流感病毒 3 型检测技术规范 1 范围 本文件规定了绵羊、山羊副流感3型的临床诊断、病原分离、RT-PCR、ELISA方法的诊断技术要求。本文件适用羊饲养场(户)和动物疫病检疫、诊疗单位对羊副流感病毒3型的检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期
3、的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。羊副流感病毒 3 型 caprine Parainfluenza virus type 3,CPIV3 属于副黏病毒科,呼吸道病毒属成员,为有囊膜的单股负链RNA病毒(见附录A中图A.1)。4 临床诊断 感染羊主要临床症状表现为发热(体温40)、呼吸困难、流浆液性或黏脓性鼻液和咳嗽等呼吸道症状。病理剖检可见肺部实变。5 实验室诊断 病毒分离 5.1.1 试剂耗材 牛肾细胞系(MDBK细胞系)
4、、棉签、FBS、DMEM培养基、青霉素、链霉素、细胞培养板。5.1.2 仪器 电子天平、研磨仪、台式冷冻离心机、生物安全柜、CO2培养箱、倒置显微镜、冰箱。5.1.3 病料采集 5.1.3.1 鼻拭子 用无菌棉签刮取鼻道分泌物,然后放入3 mL5 mL含1000 IU/mL青霉素1000 g/mL链霉素的DMEM 培养基的冻存管中,编号,记录,于2 8 条件下保存并尽快送往实验室。5.1.3.2 血清 使用非抗凝采血管采集新鲜血液2 mL5 mL,静置分离血清,编号,记录,于2 8 条件下保存并尽快送往实验室。5.1.3.3 肺组织 疑似因CPIV3感染死亡的羊,按照NY/T 541采集肺组织
5、样品,放入离心管,编号,记录,于2 8 条件下保存并尽快送往实验室。5.1.4 样品处理 5.1.4.1 拭子 将鼻拭子样品液冻融两次,然后以6000 r/min 离心10 min,再使用一次性注射器吸取上清经0.22 m滤膜过滤除菌,-20 以下保存备用。5.1.4.2 血清 将静置分层的血清转移到灭菌离心管,-20 以下保存备用。5.1.4.3 肺组织 取体积大小为223 cm肺组织样品,按照体积比为1:31:5的比例加入含有双抗的PBS(pH7.27.4),研磨成匀浆液,冻融两次,再以6000 r/min 离心10 min,取上清经0.22 m滤膜过滤除菌,-20 下保存备用。5.1.5
6、 细胞接种 取处理过的样品接种到长满80%的24孔板MDBK细胞,每孔200 L,置于37,含5%CO2的培养箱中吸附30 min后,加入含2%FBS或NBS的细胞培养液1 mL,同时设对照组,置于37,5%CO2培养箱,培养3 d5 d,逐日观察,记录细胞病变。按上述方法盲传35代。5.1.6 结果判定 逐日观察细胞病变,表现为细胞变圆、大量脱落、贴壁细胞变长聚集形成网状(见附录A.2);当70%80%细胞出现病变时收获培养物,经反复冻融,以3000 r/min离心10 min,取上清进行5.2的检测。RT-PCR 5.2.1 试剂耗材 移液器、无菌无酶离心管、PCR管、病毒RNA提取试剂盒
7、、反转录试剂盒、PCR试剂盒、TAE缓冲液、琼脂糖、核酸染料、阳性质粒(阳性对照)、灭菌超纯水(阴性对照)、引物。5.2.2 仪器 PCR仪、台式冷冻离心机、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪。5.2.3 待检样品 处理后的样品或细胞培养物。5.2.4 病毒 RNA 提取 使用病毒RNA提取试剂盒提取已处理的待检样品、阴性对照样品、阳性对照样品RNA,并使用核酸分析仪对RNA质量及浓度进行测定。5.2.5 RT-PCR 反应体系 5.2.5.1 RT 反应 引物CPIV3-F/CPIV3-R 按照附录A.3进行引物序列合成并用无菌的DEPC处理水配制成10 mol/L。20L体系:下游引物
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