检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术讲课教案.doc

检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术

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一、检测蛋白质与蛋白质相互作用
① FRET技术（in vivo）
FRET，Fluorescence resonance energy transfer，即荧光共振能量转移技术。该技术的原理是用一种波长的光激发某种荧光蛋白后，它释放的荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白，使其释放另一波长的荧光，如下图所示：

以下图为例，若要利用FRET检测两种蛋白是否有相互作用，需将两种蛋白的基因分别与这两种荧光蛋白的基因融合，并在细胞内表达出两种融合蛋白。然后只需用紫外光对CFP进行激发，并检测GFP是否放出绿色荧光。如果能检测到绿色荧光，那么可以说明这两种蛋白可能有相互作用；反之，则是这两种蛋白没有相互作用。

② 酵母双、三杂交技术（in vivo）
酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域，即AD和BD。这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录。由此，设计不同的两个载体，一个含有AD基因（假设为A载体），另一个含有BD基因（假设为B载体）。
一般将一个已知蛋白的基因连在B载体上，作为诱饵(Bait)，将未知蛋白的基因连在A载体上，将这两个载体都转到特定的酵母细胞内，看未知蛋白与已知蛋白是否有相互作用。如果两者有相互作用，那么就可以启动报告基因的转录，从而使这个酵母细胞能在选择培养基上显现出来或者生存下来；如果两者无相互作用，那么报告基因就无法表达，那么这个酵母细胞就无法在择培养基上显现出来或者生存下来，如下图所示：

由于酵母双杂交系统不能鉴定膜蛋白间的相互作用，因此又发展出了分离泛素酵母双杂交系统。该系统的原理如下图所示：

如图所示，将泛素蛋白拆分为两个片段，即C端段(Cub)和N端段(NubG)，并在C端段的N端接上一个LexA-VP16转录因子，此时它并不能激活基因转录（因为它被限制在了C端段上，不能进入细胞核发挥作用）。
将该C端段连到一个膜蛋白上，将N端段连接到另一个膜蛋白上。若两个膜蛋白有相互作用，那么两个膜蛋白在相互靠近时会使泛素蛋白的N端段和C端段靠近结合，形成一个完整的泛素蛋白。此时泛素蛋白酶体会将这一段被泛素标记的片段降解，那么连接C端段的LexA-VP16转录因子掉落，即可进入细胞核启动标记基因的表达。

酵母三杂交的原理与双杂交一样，只是它研究的是两个蛋白和第三个成分间的相互作用，通过第三个成分使两个蛋白相互靠近。第三个成分可以是：蛋白、RNA或小分子，如下图所示：

如上图所示，在加入第三种成分前，蛋白X与蛋白Y之间并无直接相互作用，因此无法使BD和AD靠近，报告基因不能表达；当加入第三种成分后，蛋白X与蛋白Y的距离被拉近，BD和AD靠近，报告基因表达，从而可以被检测到。
③ Pulldown技术（in vitro）
Pulldown，即蛋白沉降技术，它是建立在蛋白质亲和层析的基础上的一种检测蛋白质间相互作用的分析方法。亲和层析的原理如下图所示，不同蛋白对配体的亲和程度不同，因此可以先将非特异结合的蛋白用低浓度缓冲液给清洗出去，只剩目的蛋白与层析柱结合，然后再用洗脱液将目的蛋白洗脱下来，达到纯化目的蛋白的作用。

Pulldown技术利用的是亲和层析技术以及特异的配体（如GSH或者镍）。以下图为例，将GST的基因与蛋白X的基因融合，表达出融合蛋白。将该融合蛋白的溶液过带有GSH配体的层析柱，那么这一融合蛋白就能结合在配体上，然后将待测蛋白的溶液过柱，并让其与融合蛋白反应一段时间。
接着开始进行洗脱。如果待测蛋白与蛋白X无相互作用，那么在开始清洗的时候就会被洗下来；如果在用洗脱液洗脱后才能在收集到的样品中发现待测蛋白（以及蛋白X），说明待测蛋白与蛋白X可能有相互作用。

④ Far western blot（in vitro）
Far western blot是基于western blot发展而来，其原理如下图所示。将样品蛋白用非变性的PAGE胶分离，然后转膜、封闭、洗膜，加入待测蛋白，使其与已在膜上的样品蛋白进行相互作用。接着加入带有标记（如HRP）的待测蛋白的抗体反应，最后进行显色（如加入HRP的底物），观察实验结果。

⑤ 免疫共沉淀（Co-IP）（in vivo）
免疫共沉淀是探测活体细胞内蛋白间的相互作用的一门技术。它的原理是当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内有相互作用的蛋白Y也能沉淀下来。
Co-IP的原理如下图所示，首先从细胞中提取蛋白质，获得蛋白提取液，并将其与抗体孵育，使抗体与蛋白X结合。将预处理过的protein G琼脂糖珠（Sepharose）加入到抗体与蛋白提取液的孵育液中反应，使抗体与protein G结合。通过离心将琼脂糖珠沉降到管底，去除上清液，然后再用缓冲液将琼脂糖珠冲洗数次，最后用western blot（或SDS-PAGE）进行检测。

二、检测蛋白质与DNA相互作用
① DNA foot printing（in vitro）
DNA foot printing的原理如下图所示。将DNA的一个3’端用32p标记，然后将DNA分成两份，一份直接用DNase Ⅰ进行不完全酶切；另一份先与待测蛋白混合反应一段时间，然后再用DNase Ⅰ进行不完全酶切。然后将两份样品用变性的PAGE胶进行电泳，观察电泳结果。下图中，由于待测蛋白与DNA结合的部位无法被DNase Ⅰ酶切降解，因此它的电泳结果中与直接用DNase Ⅰ进行处理的样品相比，会缺少一段；如果待测蛋白与DNA无相互作用，那么这两组的电泳结果应当一致。

② EMSA（in vitro）
EMSA，Electrophoretic Mobility Shift Assay，又称凝胶阻滞实验。其原理是与蛋白质结合的DNA在Native-PAGE胶（非变性胶）上比没有结合蛋白的DNA移动速率要慢，因此通过电泳即可看到DNA的变化，如下图所示。

③ Screen a Phage cDNA-library by DNA probe（in vitro）
该方法又成为原位筛选法，用于检测cDNA文库中的蛋白与DNA探针之间的相互作用。其原理和实验流程如下图所示，首先是用噬菌体（phage）侵染大肠杆菌，然后将这些大肠杆菌涂到平板上。接着进行转膜，将膜泡于IPTG水溶液中数小时，然后将该膜放于平板上，培养数小时（IPTG能诱导大肠杆菌表达文库蛋白）。将膜取出，进行变性、复性和封闭（过夜），然后与放射性标记的DNA探针进行反应，最后洗膜、晾干并用胶片曝光。如果胶片上出现了条带，说明该文库蛋白与DNA探针有相互作用；反之则说明两者无相互作用。

④ 酵母单杂交系统（in vivo）
酵母单杂交系统的原理与双杂交一样，不同的是它主要用于考察cDNA文库中的蛋白与DNA（即特异的已知靶因子）是否有相互作用。其原理如下图所示。首先需要构建一段序列（黑框），它含有至少3个拷贝的特异的已知靶因子以及报告基因的序列。将该序列整合到酵母的基因组中，得到重组酵母。接着构建一个融合表达载体，它含有待考察蛋白的基因序列与转录激活结构域的序列。将该融合表达载体转入酵母中，观察报告基因是否能正常表达。如果报告基因正常表达，说明该cDNA文库蛋白与已知的靶因子间可能有相互作用；反之，则说明两者无相互作用。

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