DB15T 2555-2022原代奶牛乳腺上皮细胞分离培养及鉴定技术规程-乳汁分离法.pdf
《DB15T 2555-2022原代奶牛乳腺上皮细胞分离培养及鉴定技术规程-乳汁分离法.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《DB15T 2555-2022原代奶牛乳腺上皮细胞分离培养及鉴定技术规程-乳汁分离法.pdf(12页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、 ICS 65.020.30 CCS B40 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 25552022 原代奶牛乳腺上皮细胞分离培养及鉴定技术规程-乳汁分离法 Technical regulation of the isolation,primary culture and identification of Bovine Mammary Epithelial Cells derived from fresh milk 2022-04-25 发布 2022-05-25 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构
2、和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会(SAM/TC 19)归口。本文件起草单位:内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古大学。本文件主要起草人:杜瑞平、王潇、特日格勒、张兴夫、崔新洁、赵濛、云伏雨、张春华、羿静、康长清。原代奶牛乳腺上皮细胞分离培养及鉴定技术规程-乳汁分离法 1 范围 本文件规定了乳汁分离法培养鉴定原代奶牛乳腺上皮细胞的术语与定义、材料、仪器和试剂耗材、操作步骤等技术要求与规范。本文件适用于从奶牛乳汁中分离培养和鉴定原代奶牛乳腺上皮细胞。2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。原代奶牛乳腺上皮细胞 prima
3、ry bovine mammary epithelial cells 从奶牛乳汁或乳腺中分离、培养并鉴定出来的上皮细胞。免疫荧光技术 immunofluorescence technique 又称荧光抗体技术,是以荧光物质标记抗体,利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的检测和定位。染色体组型分析 karyotype analysis 对不同生物的染色体组型(有丝分裂中期的染色体数目及其特征)进行定性和定量的分析和研究。4 材料 乳汁来源 泌乳前期(22 d100 d)健康奶牛。取样 用无菌水及75%酒精擦洗奶牛乳房,挤牛乳约500 mL分装于灭菌的蓝盖瓶中,37 保温瓶保温带回实验室。5
4、仪器和试剂耗材 仪器 生物安全柜,CO2培养箱,高压蒸汽灭菌锅(137,0.25 MPa),普通光学显微镜,超低温冰箱(-50-86),PCR仪,电泳仪,凝胶成像仪,低速冷冻离心机(2000 g,-8 10),低温高速台式离心机(20000 g,-8 10),酶标仪,恒温水浴锅,倒置荧光显微镜(40 x640 x)。试剂与耗材 5.2.1 试剂 PBS缓冲液,0.25%胰蛋白酶,细胞冻存液,0.4%台盼蓝,MTT(0.5 mg/mL),二甲基亚砜(DMSO),总RNA提取试剂盒,DNA水解酶,反转录试剂盒,PCR试剂盒,Taq酶,琼脂糖,4%多聚甲醛,山羊血清(10%),兔抗人角蛋白8多克隆抗
5、体,FITC标记的山羊抗兔IgG,DAPI(10 g/mL),秋水仙素(5 g/mL),0.2%TritonX100,10%Giemsa染色液等。5.2.2 配制溶液组分 完全培养液:10%FBS+DMEM/F12+100 U青链霉素双抗+氢化考的松(1 g/mL)+孕酮(1 g/mL)+转铁蛋白(5 g/mL)+胰岛素(5 g/mL)+谷氨酰胺(200 mmol/L)+EGF(10 ng/mL)。核型分析固定液:甲醇:冰醋酸为3:1。5.2.3 耗材 T25细胞培养瓶,96孔细胞培养板,90 mm培养皿,0.22 M滤膜,15 mL/50 mL离心管,2 mL细胞冻存管,无酶PCR管,移液器
6、,血球计数板等。6 操作步骤 分离培养 6.1.1 分离 6.1.1.1 在生物安全柜中,将 200 mL 乳汁与含青链霉素双抗(100 U/mL)的 PBS 按体积比 2:1 混合后,分装于 15 mL 无菌离心管中,500 g 离心 20 min,自上而下吸弃上层乳脂层及相邻乳白色浑浊层的一半。6.1.1.2 向剩余液体中加入等量含青链霉素双抗(100 U/mL)的 PBS,再次 500 g 离心 15 min,自上而下缓缓吸弃大部分上清层,重复上述步骤,直至剩余 1 mL 左右。6.1.1.3 将所有剩余液体收集于一个 15 mL 无菌离心管中,等量 PBS 重悬,500 g 再次离心
7、5 min,自上而下缓缓吸弃大部分上清层,重复上述步骤,直至剩余 1 mL 左右,即为乳汁中分离到的细胞层。6.1.2 培养 向细胞层中加入5 mL完全培养液,接种于T25细胞培养瓶中,于37、5%CO2培养箱中培养,每隔48 h换液。待细胞形成单克隆后,原瓶胰酶消化,长至80%汇集时,传代培养。传代培养 待细胞长至80%汇集时,吸弃培养液,用PBS清洗细胞两次;T25培养瓶加1 mL胰酶消化液,37 消化10 min,普通光学倒置显微镜下观察到细胞变圆脱落后,加入至少200 L胎牛血清终止消化,反复吹打细胞,使细胞完全脱落,300 g离心5 min,弃上清,将收集的细胞按1:3的比例接种于新
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- DB15T 2555-2022原代奶牛乳腺上皮细胞分离培养及鉴定技术规程-乳汁分离法 2555 2022 奶牛 乳腺 上皮细胞 分离 培养 鉴定 技术规程 乳汁 分离法
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【Fis****915】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【Fis****915】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。