DB32_T 3680-2019玉米粗缩病病原免疫斑点检测方法.pdf
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1、ICS 65.020.20 B 16 DB32 江苏省地方标准 DB32/T 36802019 玉米粗缩病病原免疫斑点检测方法 The detection of pathogen for Maize Rough Dwarf disease by dot immuobinding assay method 2019-12-03 发布 2019-12-25 实施 江苏省市场监督管理局 发 布 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由江苏省农业科学院提出并归口。本标准起草单位:江苏省农业科学院。本标准主要起草人:周彤、杜琳琳、周益军、孙枫、兰莹、李硕、范永坚。玉米粗缩病病原
2、免疫斑点检测方法 1 范围 本标准规定了大麦、小麦、玉米植株和灰飞虱携带玉米粗缩病病原免疫斑点检测方法。本标准适用于大麦、小麦、玉米植株和灰飞虱携带玉米粗缩病病原的检测。2 斑点酶联免疫吸附检测原理 硝酸纤维素膜具有很强的静电吸附力,中性条件下即可有效地吸附蛋白质等生物大分子。将抗原吸附于硝酸纤维素膜后,可利用膜作为固相载体进行抗原抗体反应。当加入抗原的特异性抗体后,即可与膜上的抗原结合,然后再加入带有标记物的二抗,使酶标记通过二抗和相应抗体的结合间接地交联于纤维素膜上。最后加入标记物相应的底物后,标记物即可与底物作用形成不溶性产物,呈现斑点状着色。3 仪器设备与试剂材料 3.1 仪器设备 台
3、式离心机(5 000 r/min);具盖塑料离心管:200 L;培养皿(直径为90 mm);塑料盒(规格为100 mm 50 mm)。3.2 试剂材料 3.2.1 试验用水均为蒸馏水,使用的化学试剂未作说明均为分析纯级别。3.2.2 包被缓冲液:0.05 mol/L,pH值9.6。称取 1.59 g Na2CO3和2.93 g NaHCO3,加水定容至1 000 mL,用HCl调pH值至9.6,4保存。3.2.3 磷酸盐Tween 20缓冲液(0.01M PBST):0.01mol/L,pH=7.5。称取40 g NaCl,1 g KCl,1 g KH2PO4和15 g Na2HPO4,加水定
4、容至5 000 mL,用HCl调节pH值至7.5,再加入2.5 mLTween 20,4保存。3.2.4 磷酸盐缓冲液(0.02M PBS):0.02 mol/L,pH值7.5。称取40 g NaCl,1 g KCl,1 g KH2PO4,15 g Na2HPO4,加水定容至2 500 mL,4保存。3.2.5 1%脱脂奶粉封闭液:1 g脱脂奶粉加入100 mL磷酸盐Tween20缓冲液中,4保存。3.2.6 辣根过氧化物酶固体显色底物溶液:6 mg的4-氯-1-萘酚加入2 mL无水乙醇中,4保存备用,使用时加入10 mL 磷酸盐缓冲液中,再加入10 L H2O2。3.2.7 BCIP/NBT
5、显色底物:碱性磷酸酶底物显色试剂盒。3.2.8 单克隆抗体(单抗):玉米粗缩病病原RBSDV单克隆抗体,效价为1:5 0001:10 000,20保存。3.2.9 酶标二抗:Goat Anti-Mouse IgG Antibody,HRP(检测灰飞虱),Goat Anti-Mouse IgG Antibody,AP(检测植物),20保存。4 植物样品检测 4.1 样品制备 4.1.1 田间采集新鲜的大麦、小麦、玉米植株的茎秆或叶片,装至无菌样品袋中。标记样品编号、取样时间、取样地点,48 h内送至实验室,放置-20冰箱保存备用,避免反复冻融。4.1.2 取0.5 mg大麦、小麦或玉米的茎秆或叶
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