植物衰老生理.doc

装 订 线
实验报告

课程名称： 植物生理学及实验（甲） 实验类型：
实验名称： 植物衰老生理
姓名： 专业： 学号：
同组学生姓名： 指导老师：
实验地点： 实验日期：

一、实验目的和要求 二、实验内容和原理
三、主要仪器设备 四、操作方法与实验步骤
五、实验数据记录和处理 六、实验结果与分析
七、讨论、心得

一、 实验目的和要求
1、 熟悉提取植物组织中蛋白质的一般办法
2、 掌握MDA、SOD测定的原理及方法
3、 掌握离心机、分光光度计等仪器的使用方法
4、 了解植物衰老过程中，物质含量的变化

二、 实验内容和原理
材料：新老青菜叶片
内容：植物组织蛋白质、丙二醛含量测定
原理：
1、 蛋白质测定
考马斯亮蓝 G--250 ( Coomassie brilliant blue ，G-250 )法是利用蛋白质--染料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝 G-250 存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德瓦尔键结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由 465 nm 变成 595 nm ，通过测定 595 nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约 2 min 即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定 1 h，之后，蛋白质–染料复合物发生聚合并沉淀出来。此法灵敏度高(比 Lowry 法灵敏 4 倍)，易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。
2、丙二醛含量测定
MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸(TBA)反应，形成三甲基复合物。该复合物最大吸收峰在532nm处;最小吸收峰600nm处，消光系数为155 (mM)-1 cm-1
3、SOD活性测定
SOD是含金属辅基的酶，它催化以下反应：
02 - +02 - + 2H+ H2 02 +02
四氮唑蓝(NBT)光照还原的分光光度法：核黄素受光照产生的O2.-能将NBT还原为蓝色的甲腙，甲腙在560nm波长有最大吸收，而SOD能清除O2.-, 抑制甲腙的产生使吸收减小。通过分光光度检测SOD对O2.-的抑制率，可以表征出SOD含量。

（但是,在水性条件下NBT还原法得到的甲腙是蓝色混悬液，做长时程分析时沉淀表现尤为突出,属分光光度法检测的极端条件，使得该法实验数据重现性差；同时，在560nm波长对此法产生的甲腙进行检测,即使加入过量的SOD，也无法获得100%的对O2.-抑制率。为此，人们在增加甲腙水溶性方面做了许多改良,如添加Met、SDS、BSA助溶以及采用水溶性更好的四唑类替代物等。）

三、 主要仪器设备
分光光度计、离心机、研钵、烧杯、移液枪、试管、离心管等

四、 操作方法与实验步骤
蛋白含量的测定
制备匀浆：称叶龄差异明显的叶片各0.5g，加入5.00ml 磷酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8）于冰浴中研磨提取，匀浆液以10 000g 离心力作用下（4度）离心10min，其上清液即为蛋白提取液。
样品测定：取40ul 蛋白提取液+160ul 磷酸缓冲液于玻璃试管中，加入4.8ml 考马斯蓝溶液，混匀后放置2min，用10mm厚的比色杯在595nm 波长下比色读取OD值。对照为空白的磷酸缓冲液加上4.8ml 考马斯蓝溶液。

MDA含量的测定
1、 取上清液1.0ml 于7ml 离心管中，加TBA与TCA混合液4.0ml ，然后在离心管盖上戳一小孔，92℃水浴保温30min 。
2、 空白管：1ml Pi-butter +TBA与TCA混合液4.0ml （92℃水浴保温30min）。
3、 冷却后平衡，离心5min ；10000rpm。
4、 测定A532、A450和A600
计算
可溶性蛋白含量 (ug/g.FW)=标准曲线上查得的蛋白质量（μg）*提取液体积/（测定加样量*鲜重）
MDA（mM）=（A532-A600）/155/L （L为比色杯厚度（cm））
蔗糖对MBA-TBA反应有干扰，可用下式消除：
MDA（uM）=6.45*（A532-A600）-0.56*A450

SOD活性测定：
1、称叶龄差异明显的叶片各0.50g ，加入5.00ml 磷酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8），于冰浴中研磨提取，匀浆液以10000g 离心力作用下（4℃）离心10min，其上清液即为酶提取液。
2、取四支试管，分别在暗光条件下加入4mLNBBT反应液，取其中两支加入100uL Pi-buffer，另两支加入100uL 酶粗提取液，摇匀。加Pi-buffer 的一支放在暗处做空白。其余三支在25℃光照（4000-10000lux）并计时，9min后取出观察颜色变化，9min 后测560nmOD值。
3、根据SOD抑制NBT光化学还原的量计算SOD酶活性（unit/g.FW）。一个酶单位相当于引起4mLNBT反应液达到50％抑制所需的酶量。测定时用空白调零。

五、实验数据记录和处理：记录原始数据，相关计算公式及计算。
可溶性蛋白：

老叶
新叶
OD595
0.070
0.130
蛋白含量与吸光度所呈线性关系：y=281.3x-2.907

老叶可溶性蛋白含量 (ug/g.FW)=16.784*5/0.1=839.2ug/g.FW
新叶可溶性蛋白含量 (ug/g.FW)=33.662*5/0.1=1683.1ug/g.FW

MDA：

老叶
新叶
OD450
0.996
0.519
OD532
0.244
0.160
OD600
0.038
0.042
老叶：
MDA（mM）=（0.244-0.038）/155=0.001329 mM=1.329 uM
MDA（uM）=6.45*（0.244-0.038）-0.56*0.996=0.7709 uM
新叶：
MDA（mM）=（0.160-0.042）/155=0.0007613 mM=0.7613 uM
MDA（uM）=6.45*（0.160-0.042）-0.56*0.519=0.4705 uM
单位鲜重植物组织中的MDA含量（用消除干扰所得数据计算）
老叶：
单位鲜重植物组织中的MDA含量=0.7709*5*10-3/0.50=7.709*10-3 umol/g
新叶：
单位鲜重植物组织中的MDA含量=0.4705*5*10-3/0.50=4.705*10-3 umol/g

SOD活性测定：

含新叶提取液
含老叶提取液
光照处理的混合液
OD560
0.576
0.581
1.038
老叶：
SOD活性=（1.038-0.581）/1.038/0.5/16.784*103=52.46unit/g.FW
新叶：
SOD活性=（1.038-0.576）/1.038/0.5/33.662*103=26.44unit/g.FW

六、 实验结果与分析：根据自己和邻组的结果及分析。
1、 老叶较之新叶，可溶性蛋白量明显减少，几乎只有原来的一半左右。说明随着植物叶片的衰老，可溶性蛋白被降解，含量明显减少。
2、 MDA（mM）明显高于MDA（uM），说明蔗糖对MBA-TBA反应有明显干扰。
3、 老叶中MDA含量明显高于新叶。说明衰老过程中有MDA产生。
4、 就实验测得的新老叶片SOD值活性相差较大，老叶明显大于新叶。这与现实不符。对比其他组数据，考虑是因为两次实验，即蛋白含量测定及SOD活性实验采用的不是同一组叶片，造成了一部分影响。

七、 讨论、心得：结合理论和课外知识。
1、 第二次离心的目的
此时已经加入了TBA溶液，并经历了摇匀，且经过了沸水浴的加热，上清液中已混入不少杂质，再次离心，以免干扰显色反应的结果。
2、植物组织中还有一些物质对丙二醛鉴定（TBA法）干扰较大；
丙二醛是由植物器官衰老或在逆境条件下受伤后，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应产生，故而它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。测定植物体内丙二醛含量，通常利用TBA在酸性条件下加热与MDA反应，生成红棕色的三甲基复合物，其最大吸收波长在532nm。

由于植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时，可溶性糖增加，而且糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，在532nm处也有吸收，因此测定植物组织中MDA与TBA反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。
3、研磨、离心时为何可以不用冰浴和低温
因为TBA与MDA的反应需要酸性和高温条件，这样才能在532nm处有最大吸收。

（注：专业文档是经验性极强的领域，无法思考和涵盖全面，素材和资料部分来自网络，供参考。可复制、编制，期待你的好评与关注）