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连翘中连翘苷的提取方法研究

闫久江

摘 要：本实验采用正交实验设计法，以高效液相色谱法测定从连翘药材中提出連翘苷的量为考察指标，考察提取次数、加水倍数、提取时间3个因素。含量测定方法：色谱柱为安捷伦Cl8规格为（4.6mm×250mm，5μm）；流动相以乙腈-水（22：88）；检测波长为277nm；流速1.0mL·min-1；柱温：35℃。连翘苷对照品在50～350μg/ml范围内线性关系良好。连翘苷平均回收率分别为99.6%。连翘苷最佳提取工艺为加入8倍量水，煎煮提取90分钟，连续提取2次。本工艺稳定、可行、收率高；测定方法简便、准确。
关键词：连翘；提取；工艺
连翘为木犀科植物连翘Forsythia suspensa （Thunb.）Vahl的干燥果实。连翘分布辽宁、河北、河南、山东、江苏、湖北、江西、云南、山西、陕西、甘肃等地。连翘具有清热解毒，消肿散结等功效。《日华子本草》记载："通小肠，排脓。治疮疖，止痛，通月经。"连翘常用于痈疽、乳痈、风热感冒、神昏发斑、温病初起、温热入营、热淋尿闭等。连翘具有改善学习记忆障碍、舒张血管、抗氧化、抗菌、抗感染、解热、抗DNA损伤、防护耳毒性等药理作用。连翘苷为连翘主要成分之一。连翘苷作为药用的为木犀科植物连翘Forsythia suspensa （Thunb.） Vahl的干燥果实的提取物，具有清热、解毒、散结排脓等功效。本实验以连翘苷为指标对连翘提取工艺进行研究。
1 仪器与试药
实验室用高纯水制备器（北京科誉兴业科技发展有限公司）；TMSH-6050B超级恒温水槽（上海添时科学仪器有限公司）；FA1204CFAC型全自動內校電子分析天平（北京同德创业科技有限公司）；EX1600四元低压梯度液相色谱仪（南京皓而普分析设备有限公司）；TY-727型可见分光光度计（台州斯帕克仪器仪表有限公司）；PHS-550智能型台式酸度计（杭州陆恒生物科技有限公司）；WP-UP-Ⅲ-20精密型实验室专用超纯水机（四川沃特尔水处理设备有限公司）。连翘苷对照品（中国药品生物制品检定所提供）。乙腈（北京亚太龙兴化工有限公司）；甲醇（北京亚太龙兴化工有限公司）；乙醇（北京亚太龙兴化工有限公司）。
2 方法与结果
2.1 单因素考察
2.2.1 提取次数
取连翘除去杂质，筛去脱落的心及灰屑，至于圆底烧瓶内，分别提取四次，第一次加10倍水，煎煮提取60分钟，过滤，合并滤液，减压浓缩；第二次加10倍水，煎煮提取60分钟，连续提取两次，过滤，合并滤液，减压浓缩；第三次加10倍水，煎煮提取60分钟，连续提取三次，过滤，合并滤液，减压浓缩。第四次加10倍水，煎煮提取60分钟，连续提取四次，过滤，合并滤液，减压浓缩。采用高效液相测定浓缩膏中连翘苷含量并计算连翘苷收率。
2.1.2 加水倍数
取连翘除去杂质，筛去脱落的心及灰屑，至于圆底烧瓶内，分别提取四次，第一次加14倍水，煎煮提取60分钟，连续四次，第二次加12倍水，煎煮提取60分钟，连续四次，第三次加10倍水，煎煮提取60分钟，连续四次，第四次加8倍水，煎煮提取60分钟，连续四次，分别过滤，合并滤液，减压浓缩。采用高效液相测定浓缩膏中连翘苷含量并计算连翘苷收率。
2.1.3 提取时间
取连翘除去杂质，筛去脱落的心及灰屑，至于圆底烧瓶内，分别提取三次，第一次加10倍水，煎煮提取60分钟，连续四次，第二次加10倍水，煎煮提取90分钟，连续四次，第三次加10倍水，煎煮提取120分钟，连续四次，分别过滤，合并滤液，减压浓缩。采用高效液相测定浓缩膏中连翘苷含量并计算连翘苷收率。
2.2 正交试验设计
实验结果表明，提取次数、加水倍数和提取时间对连翘苷收率影响较大。选择提取次数、加水倍数和提取时间作为考察因素，采用正交试验法对影响提取效率的其它工艺条件进行优选。采用3个考察水平，用L9（34）正交表进行试验，因素水平表见表1。
3 含量测定
3.1 色谱条件：依据查阅文献及考查的结果，确定色谱条件如下。色谱柱为安捷伦Cl8规格为（4.6mm×250mm，5μm）；流动相以乙腈-水（22：88）；检测波长为277nm；流速1.0mL·min-1；柱温：35℃。理论板数按连翘苷峰计算应不得低于2000。
3.2 供试品溶液的制备
取提取膏适量，精密量取，加中性氧化铝0.5g，拌匀，加置中性氧化铝柱（100～120目，2g，内径1cm）上，用70%乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用50%甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，即得。
3.3 对照品溶液的制备
分别精密称取连翘苷对照品5mg，置100mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
3.4 标准曲线的制备
将浓度为50μg/ml，100μg/ml，150μg/ml，200μg/ml，250μg/ml，300μg/ml，350μg/ml的对照品溶液分别吸取20μL注入HPLC，以进样量（μg）为横坐标，峰面积积分值A为纵坐标，绘制标准曲线。试验表明，连翘苷对照品在50～350μg/ml范围内线性关系良好。
3.5 重现性试验
称取同一批的膏子6份，按测定方法项下的方法制备供试品溶液，测定含量，并计算样品的RSD值，结果RSD为0.73%，结果表明此方法的重现性良好。
3.6 回收率试验
取已知含量的同一批供试品各6份，分别精密添加一定量的连翘苷对照品，测定含量，计算回收率。平均回收率为99.6%，RSD为0.82%。
4 实验结果
按照L9（34）正交设计表条件进行试验，得到最佳提取工艺为加入8倍量水，煎煮提取90分钟，连续提取2次。本工艺稳定、可行、收率高。
参考文献
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