荧光共振能量转移.doc

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FRET技术研究PEDF和目标蛋白
之间在小鼠神经元（神经胶质细胞）的
相互作用
一、FRET技术基本原理
荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。作为共振能量转移供、受体对，荧光物质必须满足以下条件：
①受、供体的激发光要足够分得开；
②供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠。
人们已经利用生物体自身的荧光或者将有机荧光染料标记到所研究的对象上，成功地应用于核酸检测、蛋白质结构、功能分析、免疫分析及细胞器结构功能检测等诸多方面。（传统有机荧光染料吸收光谱窄，发射光谱常常伴有拖尾，这样会影响供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度，而且供、受体发射光谱产生相互干扰。最新的一些报道将发光量子点用于共振能量转移研究，克服了有机荧光染料的不足之处。相对于传统有机荧光染料分子，量子点的发射光谱很窄而且不拖尾，减少了供体与受体发射光谱的重叠，避免了相互间的干扰；由于量子点具有较宽的光谱激发范围，当它作为能量供体时，可以更自由地选择激发波长，可以最大限度地避免对能量受体的直接激发；通过改变量子点的组成或尺寸，可以使其发射可见光区任一波长的光，也就是说它可以为吸收光谱在可见区的任一生色团作能量供体，并且保证了供体发射波长与受体吸收波长的良好重叠，增加了共振能量转移效率。）

以GFP的两个突变体CFP（cyan fluorescent protein）、YFP（yellow fluorescent protein）为例简要说明其原理：CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱有相当的重叠，当它们足够接近时，用CFP的吸收波长激发，CFP的发色基团将会把能量高效率地共振转移至YFP的发色基团上，所以CFP的发射荧光将减弱或消失，主要发射将是YFP的荧光。两个发色基团之间的能量转换效率与它们之间的空间距离的6次方成反比，对空间位置的改变非常灵敏。例如要研究两种蛋白质a和b间的相互作用，可以根据FRET原理构建融合蛋白，这种融合蛋白由三部分组成：CFP（cyan fluorescent protein）、蛋白质b、YFP（yellow fluorescent protein）。用CFP吸收波长433nm作为激发波长，实验灵巧设计，使当蛋白质a与b没有发生相互作用时，CFP与YFP相距很远不能发生荧光共振能量转移，因而检测到的是CFP的发射波长为476nm的荧光；但当蛋白质a与b发生相互作用时，由于蛋白质b受蛋白质a作用而发生构象变化，使CFP与YFP充分靠近发生荧光共振能量转移，此时检测到的就是YFP的发射波长为527nm的荧光。将编码这种融合蛋白的基因通过转基因技术使其在细胞内表达，这样就可以在活细胞生理条件下研究蛋白质-蛋白质间的相互作用。
黄色荧光蛋白报告载体，如下图：

青色荧光蛋白报告载体，如下图：

一．质粒的选择及载体构建：
订购：
1.带有Sal I和Sac II两个酶切位点的小鼠PEDF过表达克隆质粒
2.带有Kpn I和Xba I两个酶切位点的小鼠目标蛋白过表达克隆质粒
3.pECFP．C1质粒
4.pEYFP．C1质粒
5. Sal I、Sac II、Kpn I、Xba I内切酶
6.dna合成酶等
二． PEDF核青色荧光蛋白（pECFP-C1）表达载体的构建及鉴定
小鼠c57PEDF序列blst获得：
1 atgcaggccc tggtgctact cctctggact ggagccctgc tcgggcacgg cagcagccag
61 aacgtcccca gcagctctga gggctcccca gtcccggaca gcacgggcga gcccgtggag
121 gaggaggacc ccttcttcaa ggtccctgtg aacaagctgg cagcagctgt ctccaacttc
181 ggctacgatc tgtaccgcct gagatccagt gccagcccaa cgggcaacgt cctgctgtct
241 ccactcagcg tggccacggc cctctctgcc ctttctctgg gagctgaaca tcgaacagag
301 tctgtcattc accgggctct ctactacgac ctgatcacca accctgacat ccacagcacc
361 tacaaggagc tccttgcctc tgttactgcc cctgagaaga acctcaagag tgcttccaga
421 attgtgtttg agaggaaact tcgagtcaaa tccagctttg ttgcccctct ggagaagtcc
481 tatgggacca ggccccggat cctcacgggc aaccctcgag tagaccttca ggagattaac
541 aactgggtgc aggcccagat gaaagggaag attgcccggt ccacgaggga aatgcccagt
601 gccctcagca tccttctcct tggcgtggct tacttcaagg ggcagtgggt aaccaagttt
661 gactcgagaa agacgaccct ccaggatttt catttggacg aggacaggac cgtgagagtc
721 cccatgatgt cagatcctaa ggccatctta cgatacggct tggactctga tctcaactgc
781 aagattgccc agctgccctt gacaggaagt atgagcatca tcttcttcct gcccctgacc
841 gtgacccaga acttgaccat gatagaagag agcctcacct ctgagttcat tcatgacatc
901 gaccgagaac tgaagactat ccaagctgtg ctgactgtcc ccaagctgaa gctgagcttc
961 gaaggcgaac ttaccaagtc tctgcaggac atgaagctac agtcgttgtt tgaatcaccc
1021 gacttcagca agattactgg caaacccgtg aagctcaccc aagtggaaca cagggctgct
1081 ttcgagtgga atgaagaggg ggcaggaagc agccccagcc caggcctcca gcccgtccgc
1141 ctcaccttcc cgctagacta tcaccttaac caacctttcc tctttgttct gagggacacg
1201 gacacggggg ccctcctctt cataggcaga atcctggacc ccagtagtac ttaa
分别在上游引物序列的5’端和下游引物的5’分别加入Sal I和Sac II两个酶切位点序列。设计引物序列如下：
Primer F：5、GTCGAC- atgcaggccctggtgctact-3、
Primer R：5、CCGCGG-ttaagtactactggggtcca-3、
其中GTCGAC为酶切位点Sal I，CCGCGG为酶切位点Sac II。引物中未
加入保护碱基。
具体构建质粒pECFP-C1-pedf步骤：
1. pedf片段的pcr扩增，提取和纯化
2. 有文献报道利用一次中间载体topo载体的构建可以相对容易的将pedf构建到pECFP-C1中，不知道这个实验需要不需要做这一步？
3. pECFP-C1质粒的扩增、提取和纯化
4. pECFP-C1质粒的酶切
5. pECFP-C1片段的去磷酸化用去磷酸化试剂盒Cloned Alkaline Phosphatase(CIAP)将pECFP-C1片段切口去磷酸化。（不知道是不是必须做这一步）
6. pECFP-C1酶切片段的纯化(~4．7kb)试剂盒(琼脂糖凝胶DNA／PCR产物小量回收试剂盒——TaKaR A：DV805A)1．2％琼脂糖凝胶回收的DNA量应大于200ng／ul
7. pECFP-C1-pedf质粒的连接和转化
8. pECFP-C1-pedf质粒的扩增、提取和纯化（菌液pcr）
9. pECFP-C1-pedf质粒的鉴定（送公司测序）
三．目标蛋白基因序列及引物设计：
分别在上游引物序列的5’端和下游引物的5’分别加入Kpn I和Xba I两个酶切位点序列。设计引物序列如下：
Primer F：5、ATGGTACC- 。。。。。。。-3、
Primer R：5、ATTCTAGA- 。。。。。。。。-3、
其中GTCGAC为酶切位点Kpn I，，CCGCGG为酶切位点点Xba I。引物中5，端加入保护碱基AT。
pEYFP-C1-目标蛋白载体的构建与上述步骤类似。
四．阳性对照质粒pECFP-C1-YFP的构建及鉴定
Primer F：5、-GTCGACATGGTGAGCAAG-3、
Primer R：5、-CCGCGGTCTAGATCCGGTG-3、
其中GTCGAC为Sal I酶切位点，CCGCGG为Sac II酶切位点。
载体具体构建过程与上述过程相同。
五．PEDF和目标蛋白在神经细胞（或胶质细胞）中的FRET研究
1.神经细胞（或胶质细胞）的培养
2. PEDF蛋白和目标蛋白在神经细胞（或胶质细胞）中的免疫荧光定位：将神经细胞（或胶质细胞）均匀种植在petri皿里，24h后待细胞贴壁。PBS液洗细胞3次，再用4％多聚甲醛固定15min，PBS液洗3次。用0.5％Triton穿孔15min，再用PBS洗3次每次5min。然后用I％BSA封闭30min。将petri皿小室内液体吸干净，加入用I％BSA按1：1000稀释好的PEDF和目标蛋白抗体，4℃过夜后，用PBS洗3次，加入二抗，37。C孵育1h。用PBS洗3次。此过程注意避光。加200ulFluo—Anti fading medium防止荧光淬灭，在共聚焦显微镜下观察。
3. 荧光融合蛋白在神经细胞（或胶质细胞）中的表达：
质粒转染48h后荧光显微镜下观察并拍照后，细胞提取总蛋白进行免疫蛋白印迹分析
4.激光共聚焦显微镜检测FRET：
利用脂质体法将pECFP-PEDF和pEYFP-目标蛋白共转染原代神经细胞。细胞接种于6孔培养板，pECFP-PEDF和pEYFP-目标蛋白共转染48h后接种于多聚赖氨酸包被过夜的培养玻片上。
选择性受体漂白荧光共振能量转移条件：
YFP：excitation：５１４ nm ；Em ission ，５４５／４０ nm ；CFP：Excitation：４５７ nm ；Em ission ，４８５／３０ nm 。（此步骤涉及激光共聚焦系统的FRET功能的使用，后面还有比较详细的软件操作，此处略去）
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