心脏成纤维细胞原代细胞培养.doc

乳鼠心肌成纤维细胞分离与培养

一、 实验动物
1~3日龄C57小鼠乳鼠10只。
二、 试剂及配制
高糖DMEM( gibco)、Ⅰ型胶原酶（MP）、0.25%胰蛋白酶(solarbo公司), 胎牛血清（gibco 160000-044）、青霉素-链霉素混合液（solarbo）。
培养液: DMEM培养基：FBS：双抗 100：10：1（45ml：5ml：0.5ml）
酶消化液:将胰蛋白酶用PBS缓冲液(pH 7.2 ～ 7.4)稀释, 配成0.1%胰蛋白酶消化液;将Ⅰ型胶原酶溶于PBS缓冲液(pH 7.2 ～ 7.4)中, 配成0.1%的胶原酶消化液。0.1%胰蛋白酶及01% Ⅰ 型胶原酶以2∶1混合, 现配现用。
三、 实验仪器
超净工作台、CO2培养箱、光学倒置显微镜、离心机……
四、 组织消化和分离细胞
1、将乳鼠于75%乙醇缸中浸泡5ｓ, 转移至超净台。用大头针将其固定在无菌的泡沫板上, 用聚维酮碘消毒胸、腹部皮肤。
2、取2把弯镊子撕开皮肤, 充分撕拉开, 再用乙醇棉签消毒。用眼科虹膜剪在剑突处正中线稍偏左向上开胸后用剪子压住胸骨右缘, 使心脏自然跳出, 用弯镊子勾住心脏根部, 取出心脏, 置于盛预冷PBS液的培养皿中。
3、将鼠心脏全部取出后, 剪去心房、剔除心脏上结缔组织、脂肪及血管, 预冷ＰＢＳ液清洗3次, 去除血污。
4、将心脏剪成约1mm ×1mm×1mm的组织块, 刮入加有搅拌子的锥形瓶中, 酶消化液冲洗剪刀及培养皿, 转移至锥形瓶中。
5、加入孵育过的酶消化液为心肌组织的5倍, 37 ℃水浴, 打开磁力搅拌器, 60r/min搅拌10min, 吸管轻轻吹打组织块1min分散细胞, 自然沉降2min后遗弃上清液。
6、再次加入消化酶液8～15ml消化8min。
五、培养细胞
1、吸取上清液入离心管, 加入预冷培养液2ml, 吹打均匀后, 1 200r/min离心4min, 弃上清, 细胞沉淀加预冷的培养液吹打后成细胞悬液用封口膜封口放于冰中备用。
2、剩余组织块重复上述过程若干次, 直到组织块消失, 分次收获细胞。

3、将分次收获的细胞悬液集中离心1次, 将所有细胞沉淀集中于一个离心管加适量培养液再离心1次。
4、弃上清液加10ml接种培养液吹打几次以散开所有的细胞团接种于培养瓶中, 在5%CO2 、95%空气、37 ℃培养箱中放置1.5h。（1h）
5、用预温至37 ℃的接种培养液轻轻洗刷培养瓶后收集培养液。
6、留下的贴壁细胞(主要含心肌成纤维细胞)加入含胎牛血清的培养液10ml继续培养, 未贴壁的细胞混悬液分瓶后在同样条件下再培养1.5h(60min), 再收集贴壁细胞。根据心肌细胞和心肌成纤维细胞贴壁时间的不同, 成纤维细胞贴壁速度较快, 先附于瓶底。这样采用反复差速贴壁1 h, 获得成纤维细胞。
7、 每2天换液1次。培养的心肌成纤维细胞2 ～ 3 天约80% ～90%细胞融合, 用0.25%胰蛋白酶消化液按1 ×105/ml细胞密度接种传代培养(约1∶3)。（培养心肌成纤维细胞2~ 3 d 至80%~ 90% 细胞融合, 用0.15%胰蛋白酶消化传代( 1：3) 。第2~ 4 代细胞用于实验。）

六、 细胞质量评价
台盼蓝染色、光学显微镜观察。（详见文献）
倒置显微镜下观察, 心肌成纤维细胞生长迅速,2~ 3 d 即呈融合状态, 细胞排列紧密, 有的交叉重叠生长, 与心肌细胞不同, 心肌成纤维细胞呈梭形, 胞体较大, 细胞浆透明, 细胞核较大, 呈椭圆形, 通常含2~ 3 个核, 无自发性搏动。

参考文献：
1、张乃菊，陈天平，祝晓光.乳鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞的原代培养[J].蚌埠医学院学报, 2010，35（6）：558-561.
2，陈勇兵, 陈如坤, 陈力, 等.乳鼠心肌成纤维细胞培养方法的改进[Ｊ] .江苏医药, 2005, 31(3):189 -190.