SN∕T 4656.9-2023 进出口纺织品生物安全检验方法 第9部分:肠出血性大肠杆菌O157:H7.pdf
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1、I C S5 9.0 8 0.9 9C C S W 0 9中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T4 6 5 6.92 0 2 3 进出口纺织品生物安全检验方法第9部分:肠出血性大肠杆菌O 1 5 7:H 7B i o s a f e t y t e s t i n g m e t h o d s o f t h e t e x t i l e s f o r i m p o r t a n d e x p o r tp a r t 9:E n t e r o-h e m o r r h a g i c E.c o l i O 1 5 7:H 72 0 2 3-0 5-0 5发布2 0
2、2 3-1 2-0 1实施中华人民共和国海关总署发 布前 言本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。本文件为S N/T 4 6 5 6 进出口纺织品生物安全检验方法 的第9部分,S N/T 4 6 5 6已经发布了如下几个部分:第1部分:白假丝酵母菌;第2部分:大肠埃希氏菌;第3部分:大肠菌群;第4部分:金黄色葡萄球菌;第5部分:菌落总数;第6部分:沙门氏菌;第7部分:铜绿假单胞菌;第8部分:通则;第9部分:肠出血性大肠杆菌O 1 5 7:H 7。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国郑州海
3、关、中检集团中原农食产品检测(河南)有限公司、中华人民共和国宁波海关、中华人民共和国深圳海关。本文件主要起草人:李轲、郭会清、禹建鹰、李传民、张亚斌、宗珊盈、谢堂堂、傅科杰、张卫理。S N/T4 6 5 6.92 0 2 进出口纺织品生物安全检验方法第9部分:肠出血性大肠杆菌O 1 5 7:H 71 范围本文件规定了进出口纺织品中肠出血性大肠杆菌O 1 5 7:H 7的检验方法。本文件适用于进出口纺织品肠出血性大肠杆菌O 1 5 7:H 7的检验。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的
4、引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法S N/T 1 5 3 8.1 培养基制备指南 第1部分:实验室培养基制备质量保证通则S N/T 1 5 3 8.2 培养基制备指南 第2部分:培养基性能测试实用指南S N/T 4 6 5 6.8 进出口纺织品生物安全检验方法 第8部分:通则3 术语、定义和缩略语3.1 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.1 纺织品生物安全 b i o s a f e t y o f t e x t i l e s一般是指纺织品中携带的有害生物本身或其代谢产物对生态环境和人体健康产生的潜在威
5、胁,及对其所采取的一系列有效预防和控制措施。3.1.2 肠出血性大肠杆菌O 1 5 7:H 7 E n t e r o h e m o r r h a g i c E s c h e r i c h i a c o l i O 1 5 7:H 7肠出血性大肠杆菌O 1 5 7:H 7是肠出血性大肠杆菌的主要致病菌株,是与公共卫生有关的最重要的出血性大肠杆菌的血清类型,是一种可引起人或牲畜肠出血性腹泻等疾病的细菌性病原体。此病原细菌为革兰氏染色阴性、两端钝圆的短杆菌,最适生长温度为3 7,不发酵或迟缓发酵山梨醇,不能分解4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)产生荧光。3.1.3 实时荧光 P
6、 C R r e a l t i m e P C R在P C R反应体系中加入荧光基团,利用荧光化学物质的积累实时监测P C R扩增产物总量的方法。3.1.4 C t值 C y c l e t h r e s h o l d每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。1S N/T4 6 5 6.92 0 2 3.2 缩略语下列缩略语适用于本文件。MUG(4-M e t h y l u m b e l l i f e r y-D-G l u c u r o n i d e):4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷。P C R(p o l y m e r a s e c h a i n r e
7、 a c t i o n):聚合酶链式反应。D NA(d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d):脱氧核糖核酸。T a q(T h e r m u s a q u a t i c u s):水生栖热菌。d NT P(d e o x y r i b o n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e):脱氧核苷酸三磷酸。4 材料和设备4.1 无菌剪刀、镊子。4.2 电子天平:感量0.0 1 g。4.3 无菌均质袋。4.4 拍击式均质器:4 0 0 mL。4.5 无菌规格板:2 0 c m2。4.6 无菌干燥棉拭子。4.
8、7 微量移液器:量程0.5 L2 0 L,量程1 0 0 L1 0 0 0 L,量程1 mL1 0 mL。4.8 恒温培养箱:3 6 1。4.9 接种环。4.1 0 长波紫外光灯:3 6 5 n m,功率6 W。4.1 1 全自动微生物生化鉴定系统。4.1 2 载玻片。4.1 3 灭菌离心管:1.5 mL。4.1 4 P C R反应管。4.1 5 高速冷冻离心机:2 0 0 0 r/m i n1 3 0 0 0 r/m i n。4.1 6 荧光P C R仪。5 培养基和试剂除有特殊说明,所有实验用试剂均为分析纯;分子检测实验用水符合G B/T 6 6 8 2中一级水的要求。5.1 改良胰蛋白胨
9、大豆肉汤(mT S B):符合附录A中A.2。5.2 改良山梨醇麦康凯(C T-S MA C)琼脂:符合附录A中A.3。5.3 营养琼脂:符合附录A中A.4。5.4 吲哚培养基:符合附录A中A.5。5.5 柯凡克试剂:符合附录A中A.6。5.6 MR-V P培养基:符合附录A中A.7。5.7 甲基红试剂:符合附录A中A.8。5.8 V-P甲、乙液:符合附录A中A.9。5.9 西蒙氏柠檬酸盐培养基:符合附录A中A.1 0。5.1 0 月桂基硫酸盐胰蛋白胨-MUG(L S T-MUG):符合附录A中A.1 1。5.1 1 山梨醇发酵管:符合附录A中A.1 2。5.1 2 生化鉴定试剂盒。2S N/
10、T4 6 5 6.92 0 2 5.1 3 肠出血性大肠杆菌O 1 5 7和H 7诊断血清。5.1 4 灭菌双蒸水。5.1 5 D NA提取液:2 0 mm o l/L T r i s-HC l,2 mm o l/L E D TA,1.2%T r i t o n X-1 0 0(p H 8.0),也可使用商业化的D NA提取试剂盒。5.1 6 1 0P C R缓冲液:2 0 0 mm o l/L T r i s-HC l(p H 8.4),2 0 0 mm o l/L氯化钾,1 5 mm o l/L氯化镁。5.1 7 d NT P混合液(1 0 mm o l/L):每种核苷酸浓度1 0 mm
11、o l/L。5.1 8 引物和探针:引物和探针序列符合附录B。5.1 9 T a q D NA聚合酶(5 U/L)。5.2 0 标准菌株:大肠杆菌标准菌株(C I C C 1 0 3 8 9或等效标准菌株),肠出血性大肠杆菌O 1 5 7:H 7标准菌株(C I C C 2 1 5 3 0或等效标准菌株)。6 样品制备6.1 样品制备方法6.1.1 称量法无菌方法打开送检样品,用无菌剪刀(4.1)均匀剪样,在电子天平(4.2)上准确称取剪下的样品2 5 g,剪碎后加入到盛有2 2 5 mL mT S B(5.1)的无菌均质袋(4.3)中,用拍击式均质器(4.4)拍打1 m i n 2 m i
12、n,充分混匀。6.1.2 多点采样洗脱法无菌方法打开送检样品,在样品四周和中间均匀布控5个采样点,用无菌规格板(4.5)比照每个采样点按4 c m5 c m(2 0 c m2)面积范围剪裁,每2 0 c m2采样面积为1份检样,每件样品共采集5份检样,采样面积为1 0 0 c m2。将上述采集好的5份检样放入盛有2 0 0 mL mT S B(5.1)的无菌均质袋(4.3)中,用拍击式均质器(4.4)拍打1 m i n2 m i n,充分混匀,得到一个样品洗脱液。6.1.3 棉拭子涂抹法无菌方法打开送检样品,用mT S B(5.1)湿润无菌干燥棉拭子(4.6),在样品四周和中间均匀布控5个采样
13、点,用无菌规格板(4.5)比照按每个采样点2 0 c m2面积范围均匀涂抹,每个采样点用1个无菌干燥棉拭子(4.6),在4 c m5 c m(2 0 c m2)面积范围均匀涂抹,立即用无菌剪刀(4.1)剪去棉拭子手接触部分,将涂抹部分一起放入盛有5 0 mL mT S B(5.1)的无菌均质袋(4.3)中混匀。6.2 样品制备方法选择原则6.2.1 样品制备一般依6.1.1方法为基准方法;6.2.2 当样品为面积较大或较厚实或多孔时,样品制备应采用6.1.2方法。采用6.1.2方法时如果被检样品面积过大或过小,采样点可按比例增加或减少。6.2.3 当样品质地致密不容易剪碎制备;或样品较贵重,客
14、户要求无损检测的,样品制备应采用6.1.3方法。6.2.4 采用6.1.1、6.1.2方法时如果被检样品大量吸水而导致不能吸出足够样品匀液转种时,稀释液可适当增加直至足够吸出转种。3S N/T4 6 5 6.92 0 2 7 方法一 肠出血性大肠杆菌O 1 5 7:H 7传统检验方法7.1 原理利用肠出血性大肠杆菌O 1 5 7:H 7不能发酵或迟缓发酵山梨醇的特性,接种含山梨醇的C T-S MA C琼脂平板进行初筛分离;利用肠出血性大肠杆菌O 1 5 7:H 7不能分解4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)产生荧光(MUG试验阴性)的特性,结合血清学实验,准确判定肠出血性大肠杆菌O 1
15、5 7:H 7。7.2 检验程序检验程序见图1。图1 肠出血性大肠杆菌O 1 5 7:H 7传统检验方法程序7.3 操作步骤7.3.1 增菌将按6.1制备好的样品匀液放入3 6 1 恒温培养箱(4.8)中,增菌培养2 4 h2 h。7.3.2 分离用无菌接种环(4.9)挑取7.3.1增菌液接种于两个C T-S MA C(5.2)平板。放置3 6 1 恒温培养箱(4.8)培养2 4 h2 h。培养结束后观察各个平板上菌落生长情况,如无可疑或典型菌落生长,可直接报告样品中肠出血性大肠杆菌O 1 5 7:H 7未检出;如有可疑或典型菌落长出,则挑取可疑或典型菌落纯化后进行生化试验和血清学试验确认。C
16、 T-S MA C平板上肠出血性大肠杆菌O 1 5 7:H 7典型菌落特征淡褐色中心、扁平透明、边缘光滑。7.3.3 纯化菌落分别挑取C T-S MA C选择性平板上5个以上可疑或典型菌落,接种营养琼脂(5.3)平板,于3 6 1 培养2 4 h2 h纯化,挑取纯化后的菌落同时做如下确证实验。4S N/T4 6 5 6.92 0 2 7.3.4 生化试验7.3.4.1 吲哚试验挑取7.3.3纯化后的单个菌落接种吲哚培养基(5.4),置3 6 1 培养2 4 h2 h后滴加柯凡克试剂(5.5)0.1 mL,阳性反应出现红色环,阴性为黄棕色环。肠出血性大肠杆菌O 1 5 7:H 7能分解色氨酸产生
17、吲哚,试验阳性。7.3.4.2 MR-V P试验挑取7.3.3纯化后的菌落分别接种两管MR-V P培养基(5.6),3 6 1 培养2 4 h2 h后,一管滴加甲基红试剂(5.7)2滴3滴,立即观察结果;一管按62的比例依次滴加V-P甲、乙液(5.8)后3 0 m i n内观察结果。变红色为阳性,不变色为阴性。肠出血性大肠杆菌O 1 5 7:H 7能分解葡萄糖,加入甲基红指示剂立即显红色,即MR试验阳性,滴加V-P甲、乙液后颜色不变,即V P试验阴性。7.3.4.3 柠檬酸盐试验挑取7.3.3纯化后的单个菌落接种西蒙氏柠檬酸盐培养基(5.9)后3 6 1 培养4 8 h2 h,观察其颜色变化情
18、况。肠出血性大肠杆菌O 1 5 7:H 7不能利用柠檬酸盐为碳源,柠檬酸盐试验阴性。培养基颜色不变。7.3.4.4 MU G试验挑取7.3.3纯化后的单个菌落接种L S T-MUG肉汤管(5.9),同时取大肠埃希氏标准菌 株(C I C C 1 0 3 8 9或等效标准菌株)(5.2 0)菌液接种L S T-MUG肉汤管做阳性对照,取肠出血性大肠杆菌O 1 5 7:H 7标准菌株(C I C C 2 1 5 3 0或等效标准菌株)(5.2 0)菌液接种L S T-MUG肉汤管(5.9)做阴性对照。于3 6 1 培养2 4 h2 h。培养结束后将L S T-MUG肉汤管置长波紫外灯(4.1 0)
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