香兰素的合成方法及技术展望.doc

香兰素的合成方法及技术展望
吴志尚 化工一班 3014207025
（天津大学化工学院，天津 300072)

摘要：香兰素是世界上最重要的香料之一，广泛应用在食品饮料、香精香料和医药工业等领域中, 全球每年的需求量超过16000t。鉴于人们对纯天然绿色食品的追求日益增长，天然香兰素高效的生产方法也成为研究的热点。本文综述了香兰素的多种不同的合成途径以及合成关键因素等方面的研究进展, 分析探讨了不同合成途径的优劣之处。并展望了利用微生物高产天然香兰素存在的瓶颈以及有潜力的发展方向。
关键词：香兰素；天然香料；合成途径

The synthesis methods of vanillin
and technical outlook
Wu Zhishang Class 1 3014207025

(School of chemical engineering institute，Tianjin University，Tianjin 300072)

Abstract：Vanillin is one of the most important flavoring compounds, and it is widely used in the food industry, spice fragrance, and medicine industry, etc. The annual worldwide consumption
is estimated over 16 000 tons. Due to people’s increasing concern for natural food,the product
of natural vanillin has become the major point of scientific research. By comparing different production methods of vanillin, we concluded that the microbial transformation to vanillin is the most promising method. Research developments on different biosynthetic pathways for vanillin, as well as the genes and enzymes involved, were discussed. In addition,the advantages and disadvantages of each pathway were compared and explained. Finally, the existing bottlenecks in biosynthesis of high-yield natural vanillin with the help of genetic and metabolic engineering, and the potential development direction in this field were elucidated.
Keywords：Vanillin; Natural spices ; Synthetic pathway

香兰素(Vanillin, 4-羟基-3-甲氧基苯甲醛)主要存在于天然植物香荚兰中, 是世界上最重要的香料之一。香兰素的晶体为白色针状，呈香兰荚特有的香气，它微溶于冷水，易溶于热水、乙醇、乙醚、氯仿和热挥发油中[1]。其化学结构为:

图1香兰素化学结构式

香兰素独特的无法用人工方法复合而成的香气, 使得她在许多领域得到广泛应用。香兰素大部分应用于食品工业中, 是高档食品不可缺少的调香原料, 在香精香料、饮料和医药工业中也发挥重要作用, 全球每年的需求量超过16000t[2]。市场上供应的香兰素有两种——

合成香兰素和天然香兰素。化学法合成的香兰素, 供大于求, 市场价格较低, 每公斤不到15 美元。这种香兰素不仅香型单一,而且合成过程中污染严重而无法被人们接受[3]。天然香兰素主要是从天然香荚兰中提取,但是香荚兰种植区域有限,产量受气候影响大,劳动强度大,得到的天然香兰素价格极其昂贵,每公斤售价高达4000美元,约为合成香兰素的300倍。目前最具潜力的生物合成法具有原料天然且廉价易得,生产过程清洁无污染,快速高效等优点,利用生物技术手段(微生物转化法)生产天然香兰素已成为一种值得推广的新渠道。但该种方法尚未达到工业生产的高产量目标及规模，且生物合成法的产品分离纯化过程略显复杂，如何达到工业化生产需要的高产量,并且使下游的产物分离纯化过程简单化、经济化,实现更高的经济效益,仍是天然香兰素价格居高不下的主要限制因素[4],这也是现阶段科学研究领域的瓶颈,亟待突破性的创新研究。
香兰素的合成主要包括：化学合成法、天然萃取法、生物合成法。它们的具体内容如下所述。

1.化学合成法制备香兰素

文献报道化学合成法制取香兰素的方法较多，主要有松柏苷法，木质素法，黄樟素法，丁香酚法，对羟基苯甲醛法，对甲酚法，愈创木酚法，电解氧化法等。

1.1松柏苷法

此法由松柏苷在无机酸和酶的作用下水解成松柏醇，再经氧化得香兰素。该方法在目前的工业化生产中已基本被淘汰[5]。

1.2 木质素法

木质素（英语：Lignin）是一种广泛存在于植物体中的无定形的、分子结构中含有氧代苯丙醇或其衍生物结构单元的芳香性高聚物。木质素广泛存在于废木材、秸秆、泥炭、纸浆废液和酒糟中，可以利用这些废弃物中所含的木质素来制备香兰素。
安徽理工大学李广学[6]等利用造纸废液经磺化，氧化后生成香兰素收率最高可达10.8%。

虽然木质素法生产香兰素的收率不高，但从原料资源和生产方法来看以木质素为原料生产香兰素为造纸废液的综合利用开辟了一条新路，很有发展前途，需要进一步研究开发。

1.3 黄樟素法

黄樟素(Safrole)是许多食用天然香精如黄樟精油,八角精油和樟脑油的主要成分,约占黄樟精油的80%。黄樟素在用肉豆蔻,日本野姜,加州月桂树等香料制成的香精中也有少量存在。黄樟精油常被用作啤酒和其他酒的风味添加成分。黄樟树(Sas-safras albidum)树根皮也是流行的一种药用滋补茶—黄樟茶的主要成分。
此法以黄樟素(来源于樟脑油) 在碱性条件下异构化，再氧化为胡椒醛，然后再在PCl5作用下制成原儿茶醛，最后经硫酸二甲酯甲基化得香兰素[7]。

该方法由于工艺路线较长，原料来源困难，成本较高，所以该方法目前使用较少。

1.4 丁香酚法

本方法根据氧化方法的不同可分为直接氧化法，间接氧化法，电化学氧化法，但工业上生产香兰素一般采用直接氧化法。该工艺流程为，以丁香酚为原料，与强碱共热，异构化为异丁香酚，然后将异丁香酚直接氧化。该工艺生产的香兰素香气较好，但原料来源困难，生产成本高，产品收率约60%，目前只有少数厂家采用该工艺，且总体产量很小[7]。

1.5 对羟基苯甲酸法

本方法以对羟基苯甲醛为原料，经溴化，然后甲氧基化而得到香兰素。

浙江大学韩伟等用此法以CuCl 为催化剂制得香兰素，最终收率可达80%左右。周宁章等也对此法进行了深入研究，以氯化溴为溴化剂，以DMF 和甲醇的混合物为溶剂，两步反应每步的收率均在93% 以上，总收率在85%以上。虽然该工艺路线，操作简单，步骤少，产率高，但原料价格偏高[6]，国内没有直接采用该工艺生产香兰素的相关报道。
1.6 对甲酚法
对甲酚法又可以分为两种，分别为对甲酚先氧化后卤化法和对甲酚先卤化后氧化法。对甲酚先氧化后卤化法实际上是对羟基苯甲醛法的延伸。

该法操作简单，第一步反应收率达91%，且可直接用于下一步合成，总收率可达到85%，较对甲酚先卤化后氧化法产率高。该法目前国内研究比较多，我国有丰富的甲酚资源，因此有一定的发展前景，但目前国内外尚未有采用此法大规模生产的报道[8]。

1.7 愈创木酚法

愈创木酚法[10]合成香兰素的工艺比较成熟，为目前合成香兰素工业采用的主流方法。愈创木酚法又可分为以下方法: 亚硝基法、甲醛法、Reimer － T iemann法、氯乙醛法、乙醛酸法、电解氧化法等[11]。

1.7.1亚硝基法

以愈创木酚和乌洛托品、对亚硝基二甲苯胺为原料,经缩合-氧化-水解而得,反应式：

该法分离过程复杂, 反应效率低, 生产收率约57% ,三废严重,生产1t香兰素约产生20t的废水(含有酚类、醇及芳香胺、亚硝酸盐) ,很难进行处理,另有1～ 2t的固体渣。该工艺在国外已被淘汰,但还是我国主要的生产方法,目前国内生产规模较大的厂家已经着手改进此法,如吉化公司、中华化工集团等已将工艺改为乙醛酸法[11]。

1.7.2 乙醛酸法

愈创木酚在碱性条件下与乙醛酸经缩合成3-甲氧基-4-羟基苯乙醇酸(又称扁桃酸) ,然后在催化剂作用下氧化脱羧得粗品,经提纯得到香兰素。反应式为:

国外对乙醛酸法的研究比较早，而且目前也多采用此方法来生产香兰素。Hodny Ivo 等［12］研究发现，碱性条件下，愈创木酚与乙醛酸60℃反应24 h，得到扁桃酸，然后在EDTA 铜配合物的催化下氧化，最后再在甲苯中酸化脱羧得香兰素，转化率为80% ( 以扁桃酸计) 。Nobel Dominique采用自制催化剂，在碱性条件通空气氧化，扁桃酸的转化率可高达86%，最后脱羧可得香兰素。
Rajendra G． Kalikar 等给出的乙醛酸、愈创木酚缩合的最佳条件为:反应时间

7h,n(创木酚)∶n(醛酸)∶n(氢氧化钠) 1∶1∶2，采用半间歇加料方式,将碱溶液和乙醛酸一起滴加，愈创木酚的转化率为74% ～ 77%;氧化反应最佳条件: 搅拌速度为2000r/min,反应温度为95℃,空气流量为1 mL/s，n(氢氧化铜)∶n(扁桃酸)0.5∶1，扁桃酸的转化率为88%。游佳勇等［13］研究了扁桃酸制备中温度、物料比、催化剂、压力对产率的影响，通过选择合适的反应条件提高了香兰素的产率，缩短了反应时间。
魏国峰等［14］研究了3 种自制催化剂对愈创木酚－ 乙醛酸法合成香兰素缩合反应的影响，研究发现在某一催化剂催化质量分数为4%时，乙醛酸的转化率可达95.8%，扁桃酸的选择性可达85.3%。周亚婷等［14］对缩合反应中的反应温度、反应液的pH值、加料方式、原料配比以及氧化反应中的催化剂、介质的pH 值、反应时间、温度等反应条件进行了优化，使香兰素总收率达到75%，产品纯度＞99%。

1.7.3 甲醛法

由愈创木酚和甲醛进行反应得香兰醇,再由香兰醇与对亚硝基- N, N- 二甲基苯胺氧化反应得香兰素。为了增加香兰素的收率,在反应过程中用铜和氯化亚铜作催化剂,反应式为:

1.8电解氧化法

先将愈创木酚和乙醛酸进行缩合反应，再将反应液加入电解反应槽中，加人固碱使溶液成强碱性，不需加其他催化剂和氧化剂，按照一定电流密度进行电解氧化反应，生成的愈创木酚羰基羧酸不必分离，再调节溶液呈弱酸性时，即会脱梭生成香兰素且收率可达90%以上[5]。

李云等［15］通过缩合反应合成扁桃酸，再经电解氧化制备香兰素。研究了电流强度、电解时间、碱浓度对收率的影响，电解氧化反应收率可达92%。
韦星船等［16］也研究了电解氧化法制香兰素的工艺，对碱的用量、电流密度、电解温度、电解时间等参数进行了优化，使得电解氧化收率达到95%。电解氧化法工艺简单，不需外加氧化剂和催化剂，省去反应液的后处理工序，减少了废液污染，而且操作平稳，反应选择性高，反应的产物纯度较高，有很大的发展前途。

1.9香兰素化学合成法总结

化学合成法一直是香兰素的主要制作工艺，由上述各种香兰素的化学合成方法可以看出，乙醛酸法凭借其原料来源广、工艺条件易控制、收率高、污染少的特点，为目前工业生产香兰素的主流方法。如何提高愈创木酚与乙醛酸的缩合产率及选择更好的氧化催化剂需进一步研究。同时化学合成法也普遍存在产物复杂，过程污染大，产品纯度不高等特点。因此对于化学合成法而言，能否开发出能够适合工业化低污染高纯度的路线，就决定其在国内是否将有重大的应用前景。

2.植物提取法

香兰素以游离态和葡萄糖苷的形式广泛存在于自然界植物中, 尤其在香荚兰豆中, 含量约为20 g/kg (干重)。世界香荚兰产地目前主要集中在马达加斯加、印度尼西亚、科摩罗、留旺尼、乌干达、墨西哥和塔希提等岛屿国或地区[17]。香荚兰的深加工产品主要是香荚兰浸剂, 方法是先将香荚兰切碎放入浸提器中, 用95%的乙醇在50℃-60℃条件下浸提, 过滤后即可。这种方法成本高、费时, 且溶剂会残留。采用超临界溶剂萃取技术[18], 无毒、无溶剂残留、在加工过程中也不接触空气, 因此香兰素不会发生水解、氧化和酯化等反应, 收率也较高。
植物提取法有其自身的优点，而且从植物香荚兰中提取的香兰素是天然的, 但由于香荚兰的种植区域有限, 产量受气候影响大, 作物种植及加工处理劳动强度太大[18], 生产的天然香兰素远不能满足市场的需求。

3.生物转化法
3.1植物细胞培养法

1991 年Knuth 等提出, 香草愈伤组织细胞悬浮培养物会分泌出一种复杂的带香荚兰香味的物质, 在不加前体物的条件下用活性炭连续提取14 d 后, 可以得到0.099 g/L 香兰素。另有研究者尝试利用组织培养香荚兰(Vanilla)和辣椒(Capsicum)来生产香兰素, 产量都非常低, 离工业化应用还有很大的距离。

3.2 酶转化法

酶促反应具有高效、专一, 反应条件温和, 能耗低, 污染小等优点。在香兰素的生产中, 也有酶法合成的报道。van den Heuvel 等发现利用香草醇氧化酶(Vanillyl-alcoh oloxidase,

VAO)可以生产香兰素[19], 底物木焦油醇在VAO 的催化下经香草醇氧化合成香兰素。

3.3 微生物转化法

鉴于香兰素广泛应用于食品工业中, 其是否天然、健康备受消费者的关注。以天然原料为底物, 利用生物技术, 经微生物转化生产的香兰素经欧洲和美国的食品法规认可为天然的香兰素。经过数十年的研究, 迄今已报道的利用微生物转化法生产天然香兰素的最高产量达到19.2 g/L
利用微生物转化法生产香兰素的底物主要为丁香酚和阿魏酸。

3.3.1以丁香酚为底物的香兰素代谢合成法

工业上,丁香酚主要是从丁香油等植物精油中提取得到的,售价比较低廉, 每千克约5美元;但是,丁香酚对微生物具有一定的毒性,会抑制菌体的正常生长及代谢。阿魏酸是肉桂酸的衍生物, 是细胞壁的组成分之一, 在很多谷物作物中的含量非常丰富[20]。麦麸和玉米麸皮中含量分别为4-7g/kg（干重）和约30 g/kg (干重), 水稻胚乳中含量为12 g/kg, 甜菜(约5g/kg)也是阿魏酸的一个很好的来源, 酿酒工业的副产物之一[21]——大麦的废颗粒也含有少量的阿魏酸,约0.1 g/kg。阿魏酸在自然界中含量丰富，廉价易得,对菌体没有毒害作用,且以其为底物进行转化合成香兰素的产量相对较高。不失为一种理想的原料物质。因此,利用微生物的转化能力来进行天然香兰素的生产, 并借助基因工程改造等生物技术手段提高香兰素的产量,是一个非常具有潜力的研究方向[22]。

3.3.2 以阿魏酸为底物的香兰素代谢合成法

两步法合成香兰素: 1996年研究者提出了两步转化法, 第一步, 先用黑曲霉(Aspergillus niger)将阿魏酸转化为香草酸, 转化率为88%; 第二步, 再用朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)将香草酸还原为香兰素, 产率为22%, 在这一步中, 香草酸主要发生脱羧反应生成2-甲氧基对苯二酚, 仅极少部分的香草酸被还原生成香兰素, 所以香兰素的产率很低[23]。
后来陆续有优化两步法生产香兰素的报道。在培养基中加入纤维二糖可改变菌株的代谢路径, 降低甲氧基对苯二酚的水平从而积累香兰素。在转化过程中加入大孔吸附树脂吸附香兰素, 减轻其对菌体的毒害, 也有利于香兰素产量的提高[23]。
在众多的香兰素生产菌株中, 仅有极少数可以达到工业化应用的水平。由于香兰素对菌体来说是一种抑制剂大多数菌株无法耐受高浓度的香兰素, 或者部分菌株体内存在香兰素的下游代谢基因会将生成的香兰素继续降解, 最终导致香兰素的产量均比较低, 通常不超过1 g/L。据研究发现, 目前仅Amycolatopsis 和Streptomyces 两个属的多个菌株能将底物阿魏酸转化生成较高产量(超过10 g/L)的天然香兰素[24], 基本可应用于工业化生产。

图2 三步法合成香兰素代谢途径

图3 阿魏酸合成香兰素代谢途径

2007年,研究学者利用Streptomyces sp.V-1以阿魏酸为底物, 借助吸附树脂的作用, 经55 h 的发酵最终获得19.2 g/L 的香兰素, 总摩尔得率为54.5%[21]。这是迄今为止利用微生物转化法,以阿魏酸为底物生产天然香兰素获得的最高产量。

3.4 生物转化法技术评价

近十几年来, 利用微生物转化法生产天然香兰素得到愈来愈多的关注, 从代谢途径到分子水平关键基因的研究已取得了很多重要的研究成果, 但仍存在许多科学问题需要深入的探索研究, 而且高效益的工业化生产也亟待进一步的优化。目前,在酶学水平上,香兰素合成途径中关键酶的理化性质与催化机理的相关工作鲜有报道,能否甚至如何将这些酶应用于酶工程项目均处于未知状态[23]。因此,今后的研究方向应更加倾向于对这些关键酶的基本酶学性质、与底物结合位点和酶活性中心的寻找以及具体的作用机制等方面的深入挖掘, 丰富并完善香兰素合成相关领域中资源匮乏的酶学研究体系。

4.结语
香兰素不仅是一种名贵香料, 而且也是重要的化工原料, 广泛应用于农业、医药、化工等各个行业。随着其应用范围的日益扩大, 香兰素产品质量和合成方法就成为当今人们研究的热点。化学生产方法以其产率高, 成本低等特点一直占领着主导地位, 但是许多化学方法在反应过程中利用有毒愈创木酚、氯仿、丁香酚等为原料, 并且许多工艺副产品污染环境。生物化学法制备香兰素是一项新兴的技术, 属于天然的合成方法, 具有反应条件温和、
污染小, 并可回收利用造纸、农业等废料作为原料,可以预见, 一旦此法实现了“工业化” , 必将给香兰素的生产带来一场新的革命。

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