细胞实验操作基本流程.doc

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细胞实验操作基本流程
（基于明确的细胞试验计划）
1. 实验物品准备
1.1 实验耗材准备
书面准备：明确列出使用物品名称、数量，报请老师批准。
操作准备：物品清洗、干燥、打包灭菌、合理放置。
1.2 实验试剂准备
书面准备：明确列出使用物品名称、数量，报请老师批准。
操作准备：选择合适的物品存放地点；使用前集中放置；需要配制的试剂根据有无灭菌需要提前配好；需要无菌配制的试剂在无菌操作要求下配制。
2. 实验预约
2.1 操作预约：401室在预约本上登记；分析测试中心向屈老师交申请单后在预约本上登记。
2.2 细胞冻存复苏预约：每周定时开放液氮罐，由负责同学在群里通知。
2.3 细胞检测预约：填写申请单，向主管老师申请。
3. 细胞房环境检查
3.1 清洁消毒：操作前后有无清洁台面、地面，并行紫外线杀菌10-15分钟。
3.2 仪器设备：运行是否正常，有无灯光闪烁报警或标志警示，有无异常状况。
3.3 台面：是否洁净无污垢，有无多余物品放置，必要物品是否放置齐备。
4. 清洁准备
4.1 洗手：肥皂洗——5‰新洁尔灭泡手10秒——70%酒精喷手
4.2台面物品放置：正中：酒精灯；左侧：吸管及其他耗材盒子；右侧：试管架、大镊子、酒精棉球瓶、打火机、移液器；左上方：试剂瓶；右上方：废液缸
5. 实验操作
5.1 基本操作：换液、传代、冻存、接板、复苏、细胞计数、细胞观察
5.2 垃圾处理：培养基、缓冲液等使用过的无害废液用废液缸装；固体垃圾丢入垃圾筐中
6. 实验善后
6.1 可回收实验耗材处理：吸管、试管、离心管等可反复使用的耗材按标准流程清洗。
6.2 不可回收实验废物处理
6.2.1 酸碱类废液分类倒入废液瓶存放，由学院通知处理
6.2.2 无害废液弃入水槽，大量流水冲洗
6.2.3 固体垃圾放入垃圾袋，丢入垃圾桶
6.3 种子细胞处理：实验过程中需要保种或实验完成后仍有未用完的种子细胞，按标准流程进行细胞冻存，以待后续使用。
6.4 实验试剂处理：未用完的试剂重新放回合适的存放地点；如试剂污染或变质，按实验废物处理。
6.5 报备：耗材、试剂如需补充，需要向老师申请批准购买；仪器设备如有损坏，需要告知负责同学或老师进行维修。
7. 清洁值周和安全检查
7.1 清洁值周：轮流进行，以导师分组，每日例行清洁和周二、周五大扫除，需要按要求进行清洁并在值周表上登记及拍照。
7.2 安全检查：清洁值周的同时需要每天巡视细胞房、准备间内的电器设备，有情况需要及时上报。
注意事项：
1、试验计划三原则：要做什么、为什么这么做、准备怎么做
2、实验操作三原则：多看、多问、多想
3、突发事件处理：及时向负责同学、老师汇报情况
细胞操作相关仪器设备使用
恒温干燥箱使用注意事项
注意事项
(一)干燥箱恒温干燥时恒温室下方的散热板上，不能放置物品，以免烤坏物品或引起燃烧。
(二)放入箱内的物品不应过多、过挤。
(三)严禁把易燃、易爆、易挥发的物品放入箱内，以免发生事故。
(四)如果发现干燥箱箱门下方红灯报警必须尽快切断电源。
(五)放置物品干燥时间不超过24小时。
二氧化碳培养箱使用
箱门应轻开轻闭，避免粗暴开关。取出细胞时应避免箱门长时间敞开，以免培养箱内环境不稳定，孵箱中的水盆应定期（每2周左右）更换无菌双蒸水，并擦洗水盆，紫外照射30分钟。
二氧化碳气瓶更换
先关闭总阀和分压阀，更换后先开总阀，再慢慢调整分压阀，指针总阀在5分钟左右，分压阀指针在0.15左右。
超净台使用
使用超净台工作15分钟前开紫外灯进行照射灭菌，在进入操作之前应关掉紫外灯，10分钟左右后进入。超净台上力求简洁，以利于保持无菌状态，每一步操作均应用酒精擦拭，不宜对着超净台说话。
倒置相差显微镜使用
分为3点：
1. 相差装置的调换与安装。卸下普通显微镜使用的聚光器，将环状光阑装在聚光器支架上，把绿色滤光片放在上面，它可以吸收红色和蓝色光，使波长范围小的单色光线进行照明，并有吸热作用，能使相差观察获得良好的效果。再从转换器上旋下普通物镜，换上相差物镜。
2. 调焦。打开光源，旋转激光器装盘将“o”对准标示孔，使普通聚光器部分进进光路。先使用低倍相差物镜，按普通显微镜操纵方法进行对光和调焦。旋转环状光阑，使光阑的直径和孔宽与所使用的相差物镜相适应。
3. 合铀调整。拔出目镜，插进合铀看远镜，一边从看远镜内内观察，并用左手固定其外筒；一边用右手转动看远镜内筒使其下降，当对准焦点就能看到环状光阑的亮环和相板的黑环，此时可将看远镜固定住。再升降集光器并调节其下的螺旋使亮环的大小与黑环一致，然后左右前后调节环状光阑聚光器上的调节钮，使两环完全重合，如亮环比黑环小而位于内侧时，应降低集光器使亮环放大；反之，则应升高聚光器，使亮环缩小。如若升到最高限度仍不能完全重合，则可能是载玻片过厚之故，应更换。合抽调整完毕，抽出看远镜，换回目镜，按常规要领进行观察。在更换不同倍率的相差物镜时，每一次都要使用相匹配的环状光阑和重新合抽调整。使用油镜时，集光器上透镜表面与载玻片之间要同时加上香柏油。
低速离心机使用
将需要离心的样品对称放入离心机内，关好盖子，接上电源，调整转速和运转时间，按离心键。待转速降至0000后，打开盖子，取出样品。
传递窗使用
每扇门旁设面板一块，面板有一只LED显示灯，一只开门按钮和一只杀菌灯开关。显示灯为绿色时，为开门指示灯，灭表示对面的门卫开状态，禁止此门打开，按开门按钮无法打开门。亮表示允许开门，按开门按钮，门锁打开，开门传递物件。杀菌开关可以控制箱内的杀菌灯的亮和灭。
酸缸、酸筒使用
酸缸分为内缸和外缸，外缸里面放液体，内缸里面放要清洗的器皿，浸泡结束后，将内缸向上提出，内缸上面有很多的小孔，液体从内缸体小孔流出，取出物品，盖上盖子。
移液器使用
一、 标准操作
适用的液体：水、缓冲液、稀释的盐溶液和酸碱溶液。
1)按到第一档，垂直进入液面3-5毫米。
2)缓慢松开控制按钮，否则液体进入吸头过速会导致液体倒吸人移液器内部吸人体积减少。
3)打出液体时贴壁并有一定角度，先按到第一档，稍微停顿1s后，待剩余液体聚集后，再按到第二档将剩余液体全部压出。
二、黏稠或易挥发液体的移取
在移取黏稠或易挥发的液体时，很容易导致体积误差较大。为了提高移液准确性，建议采取以下方法：
1)移液前先用液体预湿吸头内部，即反复吸打液体几次使吸头预湿，吸液或排出液体时最好多停留几秒。尤其对于移取体积大的液体(如1000~1)，建议将吸头预湿后再移取。
2)采用反相移液法：吸液时按到第二档，慢慢松开控制按钮，打液时按到第二档，部分液体残留在吸头内。
微量移液器使用
使用方法同移液器的使用。
细胞计数板使用
分3点：
将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。
将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
计数板四大格细胞总数，压线细胞只计算左侧和上方的。然后按照公式计算：细胞数/ml=四大格细胞总数/4*
高压灭菌锅使用
分为6点：
1. 首先将内层灭菌筒取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。
2. 放回灭菌筒，并装入待灭菌物品。
3. 加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌筒的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。
4. 用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。
5. 灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，压力降为0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物体。
6. 将取出的灭菌培养基放入37℃恒温培养箱内培养24小时，经检验无杂菌生长，即可待用。
酶标仪使用
冰箱使用
冰箱中试剂药品分类放置，关闭冰箱时检查是否关好。
液氮罐使用
使用前，检查容器内部是否清洁干燥，充液氮前要用少量液氮预冷。不能在容器盖上放置物体和密封颈口，放进或取出冷冻物品时，要尽量使罐口打开时间短，以减少液氮消耗，也不要把提桶完全提出来。严防冲击和碰撞。严谨用硬物清除颈管内的冻霜，以免损伤颈管。
超低温冰箱使用
1. 一般制冷温度设置为-60度，过滤网每个月必须清洗一次。
2. 存取样品时门开得不要过大，存取时间尽量要短。
3. 注意经常要存取的样品放在上面两层，需要长期保存不经常存取的样品放在下面两层，保证开门时冷气不过度损耗。
4. 定期除霜。
细胞实验基本液体配制
培养基配制
PBS配制
成分配比为：1%（w/v）NaCl,0.025%KCl,0.144%,0.025%.
调整pH为7.2，在高压蒸汽灭菌锅中121（15psi）处理15分钟后室温下保存
冻存液配制
90％血清、10％DMSO
戊二醛固定液配制
2.5%戊二醛（用PBS配置）
多聚甲醛固定液配制
2%多聚甲醛（用PBS配置）
新洁尔灭洗手液配制
0.1%新洁尔灭（蒸馏水配制）
稀盐酸配制
浓硫酸配制
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