陕南水牛微卫星DNA遗传多样性研究.doc

陕南水牛微卫星DNA遗传多样性研究
王 斌1,2，昝林森1,3[收稿日期] 2023-01-17
[基金项目] 国家“十一五”科技支撑计划项目（2023BAD14B07）；西北农林科技大学拔尖人才支持计划项目
[作者简介] 王斌（1979—）男，陕西城固人，讲师，硕士，重要从事生物技术与家畜育种研究。
E－mail：
[通信作者] 昝林森（1963—），陕西扶风人，专家，博士生导师，重要从事牛遗传育种与繁殖研究。
E－mail：

，杨彦杰4，钟 昕1，黄 磊1，王洪宝1,3
（1西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2汉中职业技术学院 农林系，陕西 汉中 723000； 3国家肉牛改良中心，中国 杨凌 7121004；4河南师范大学 生命科学学院，河南 新乡453007）
[摘 要] 【目的】分析4个陕南水牛群体的遗传多样性，为陕南水牛品种的资源保护和开发运用提供支持。【方法】运用10对微卫星引物，采用PCR扩增和非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳技术，对192头陕南水牛（分别采自城固、南郑、宁强和汉滨4个群体，每群体48头）进行了遗传多样性检测，记录了各群体的等位基因频率、等位基因数、有效等位基因数（Ne）、遗传杂合度（H）、各群体间的奈氏标准遗传距离及多态信息含量（PIC），根据遗传距离进行了聚类分析。【结果】4个陕南水牛群体在10个微卫星位点共发现104个等位基因，其中有8个特有等位基因，等位基因频率为0.0052～0.3490，总群体各位点平均有效等位基因数为4.0174～13.1469；10个微卫星位点平均多态信息含量为0.7007～0.8932，均为高度多态；平均杂合度为0.7550～0.9288。聚类分析结果显示，城固群体与南郑群体一方面聚在一起，然后依次同宁强、汉滨水牛群体聚在一起。【结论】10对微卫星标记可作为有效的遗传标记用于陕南水牛遗传多样性的分析；陕南水牛群体变异限度多样性丰富，选育限度较低；聚类分析结果符合陕南水牛的地理分布格局和产区的自然环境，4个群体之间遗传差异较小,遗传一致性限度较大。
[关键词] 陕南水牛；微卫星；遗传多样性
[中图分类号] [文献标记码] A [文章编号]
Study on genetic diversity of microsatellite DNA in Shaannan buffalo
WANG Bin1,2 ,ZAN Lin-sen1,3,YANG Yan-jie4,ZHONG Xin1,HUANG Lei1,WANG Hong-bao1,3
(1 College of Animal Science and Technology，Northwest A&F University，Yangling，Shaanxi 712100,China；2 A&F Department，Hanzhong Vocation and Technology College，Hanzhong, Shaanxi 723000,China； 3 National Beef Cattle Improvement Center in China, Yangling,Shaanxi 712100,China ; 4 College of Life Sciences, Henan Normal University，Xinxiang，Henan 453007,China)
Abstract:【Objective】To analyse genetic diversity of four landraces buffalo in southern Shaanxi and to provide support for the protection and utilization of resources of buffalo species in southern Shaanxi.【Method】192 Shaannan Buffalo（were selected from Chenggu,Nanzheng,Ningqiang and Hanbin）were used to detect the genetic diversity,and counted allele frequency of each group, number of alleles, effective number of alleles (Ne), heterozygosity (H), between groups Nei's standard genetic distance and the polymorphic information content (PIC), analysize genetic distance through cluster analysis.【Result】The results indicate that there are104 alleles and 8 alleles-specific at 10 microsatellite locus in 4 local buffalo populations. The allele frequencies; average effective number of alleles and the average polymorphic information content ranging from 0.005 2－0.349 0; 4.017 4－13.146 9 and 0.700 7 － 0.893 2,meanwhile, the average heterozygosity range from 0.755 0 － 0.928 8.they were highly polymorphic. Cluster analysis showed that Chenggu groups first of all together with Nanzheng, followed with Ningqiang, Hanbin.【Conclution】10 pairs of microsatellite markers can be used as an effective genetic marker for the analysis of the genetic diversity of buffalo in southern Shaanxi.There are rich diversity of variation in Shaannan buffalo . Ananlysis of clustering showed that these consistent with the geographical distribution patterns and natural environment of Shaanan Buffalo.There are basically same at genetic basis between Four local groups (Chenggu Nanzheng Ningqiang and Hanbin)
Key words：Shaannan buffalo；Microsatellite；genetic diversity
微卫星DNA(Microsatellite DNA)，又称短串联反复(Short tandem repeats，STR)或简朴反复序列(Simple sequence repeat，SSR)，是以1～6个核苷酸为反复单位串联组成的长达几十个核苷酸的反复序列[1]，如（TG）n、（AAT）n、（GATA）n等。微卫星广泛存在于各种真核生物的基因组中，并且分布比较均匀，平均每10 kb的DNA序列中就会出现1个微卫星序列[2]。微卫星具有数量大、分布广而均匀、多态性丰富、共显性遗传以及分析方法简便、快捷、结果反复性好等优点，目前已在动植物的基因组作图、群体遗传变异分析、群体起源分析、亲子鉴定、QTL检测与定位等研究中得到广泛应用[3-5]。
陕南水牛是主产于汉中和安康盆地的地方水牛品种，重要分布于汉中、安康两市的十三县（区）[6],具有体质健壮、力大、役用性能好、耐粗饲、耐苦、耐劳、抗病性强等特点，有一定的乳、肉生产潜力，是适宜于陕南水田密集区饲养的一个重要畜种资源。目前关于陕南水牛分子水平遗传多样性的研究还比较少。张伟[7]对6个水牛类群54个个体（其中6头为陕南水牛）的mtDNA D-loop区全序列进行测序分析，从母系角度研究了中国水牛的起源。齐国强等[8]对9头陕南水牛的mtDNA D-loop 区序列(930 bp 左右)、类群之间的系统进化关系以及遗传多样性进行了分析。张毅[9]运用线粒体D-loop区序列和Y染色体SNP两类标记,分别从母系和父系两个方面，对涉及陕南水牛在内的水牛群体进行了遗传多样性和起源驯化分析。截止目前，尚未见有关运用微卫星遗传标记从分子水平对陕南水牛进行遗传多样性和发生关系的研究报道。为此，本研究运用10个微卫星位点，对陕南水牛进行遗传学检测，初步探讨其遗传多样性和遗传分化关系，以期为陕南水牛在中国水牛中系统地位的拟定及进一步开展陕南水牛品种资源保护和开发运用工作提供参考。
1 材料与方法
1.1材料
从陕南水牛中心产区城固（CG）、南郑（NZ）、宁强（NQ）、汉滨（HB）4地分别选择48头品种特性明显、没有与国外水牛杂交历史，并且个体间在3代或2代内没有血缘关系的个体，颈静脉采血（10 mL/头），ACD抗凝（V(ACD)︰V(血液)＝1︰6），轻轻晃动摇匀，置于冰盒带回实验室，于－80 ℃保存。
1.2 重要试剂
蛋白酶K、Taq DNA聚合酶、10×Buffer、dNTPs、DNA Marker，均购自北京鼎国生物工程公司。分子量标记物pBR322/MspⅠ，由北京华美生物公司提供。
1.3陕南水牛基因组DNA的制备
参照《分子克隆实验指南》[10]，采用传统的酚、氯仿抽提法并略作改善，提取陕南水牛血样基因组DNA。将DNA 用TE 缓冲液溶解，然后用15g/L琼脂糖进行凝胶电泳检测，并用紫外分光光度计测定其浓度，于－80 ℃保存备用。
1.4 PCR扩增
从2023年国际动物遗传学会（ISAG）和联合国粮农组织（FAO），推荐的用于家养水牛遗传多样性研究的微卫星引物中，筛选出10对引物（表1）用于实验，引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。
PCR反映体系为15 μL：10×Buffer(含15 mmol/L Mg2+ )1.5 μL，2 mmol/L dNTPs 1.5 μL，2 U/μL Taq DNA聚合酶0.25 μL，10 pmol/μL上、下游引物各0.6 μL，模板DNA (50 ng/μL) 1.0 μL，ddH2O 10.15 μL。PCR扩增程序：95℃预变性5min；94℃ 30 s，55～65.8℃（退火温度因引物不同而异，表1）退火35s，72℃ 30 s，32个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
表1 10对微卫星引物的PCR 条件
Table1 PCR rection conditions of 10 pairs primer of microsatellite
位点
Locus
染色体位置
Chromosomal
position
引物序列（5’→3’）
Primer sequence
退火温度/℃
Annealing temeperature
产物大小/bp
Products
CSSM033
17
CACTGTGAATGCATGTGTGTGAGC
65.8
155～209
CCCATGATAAGAGTGCAGATGACT
ILSTS012
11
TCTACCACCGATACAGATGG
61.1
109～125
GAAGTAGGTAGTGCTGGAGG
ILSTS031
24
AATTCTAGGTGAACAGCAGC
62.3
276～304
AAGACATACTCTCAGACTCC
ILSTS068
20
TGCAAAGAGTTGGATGGGGC
61.5
146～212
AAGGTTGCTGCCTCATATCC
HEL13
11
TAAGGACTTGAGATAAGGAG
55.0
137～193
CCATCTACCTCCATCTTAAC
ILSTS061
15
AAATTATAGGGGCCATACGG
55.0
133～171
TGGCCTACCCTACCATTTCC
ILSTS095
21
GAAAGATGTTGCTAGTGGGG
58.6
207～247
ATTCTCCTGTGAACCTCTCC
CSSMO19
1
TTGTCAGCAACTTCTTGTATCTTT
59.9
137～171
TGTTTTAAGCCACCCAATTATTTG
CSSM036
27
GGATAACTCAACCACACGTCTCTG
59.9
166～180
AAGAAGTACTGGTTGCCAATCGTG
CSSM041
22
AATTTCAAAGAACCGTTACACAGC
56.0
136～154
AAGGGACTTGCAGGGACTAAAACA
1.5 PCR产物的检测
用20g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将检测阳性的PCR产物用120g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶于120V条件下电泳7～8h，银染显带并用紫外凝胶成像系统照相分析。以pBR322/MspⅠ为分子量标记物，用Gel-Pro Analyzer 3.1分析软件鉴定个体等位基因片段大小及其基因型。
1.6数据记录分析
等位基因频率(Alele frequency)、等位基因数（Number of Alleles）、有效等位基因数(Effective Number of Alleles，Ne)、遗传杂合度(Heterozygosity，H)、奈氏标准遗传距离(Standard genetic distance，Ds)的计算和聚类分析，均运用Popgen32软件进行；多态信息含量(Polymorphism information content，PIC)用PIC分析软件进行计算。
2 结果与分析
2.1 陕南水牛群体基因组DNA的检测
将DNA用TE缓冲液溶解后，进行15g/L琼脂糖凝胶电泳检测，结果（图1）显示，DNA条带较亮，比较整齐，没有拖尾现象，可以进行下一步实验。
图1 陕南水牛血样基因组DNA的检测
注：图中1－12分别为12头水牛个体血样基因组DNA
Fig.1 Gel electrophoresis of Shaannan buffalo genomic DNA
Note:1－12 indicate genomic DNA of 12 buffalo in Fig. Respectively

Fig1.

2.2 陕南水牛群体等位基因的组成及等位基因频率的计算
城固、南郑、宁强及汉滨4个水牛群体在10个微卫星位点共发现104个等位基因，等位基因频率为0.0052～0.3490，其中8个为特有等位基因。8个特有等位基因中，城固水牛群体ILSTS012位点上有1个、ILSTS068位点上有3个，ILSTS095位点上有1个，该群体共有5个特有等位基因；南郑水牛群体在ILSTS068和ILSTS061位点上各有1个特有等位基因；宁强水牛群体在CSSM033位点上有1个特有等位基因。其中陕南汉滨水牛群体19头水牛个体微卫星ILSTS095的PCR扩增结果如图2所示。
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
M
16
17
18
19

404bp
309bp
242bp
217bp
207bp
180bp

图2 汉滨（HB）水牛群体19头水牛个体微卫星ILSTS095 PCR产物的电泳图谱
M. Marker;1~19. 19个汉滨水牛个体
Fig.2 Polyacrylamide gel electrophoresis of microsatellite ILSTS095 PCR products of Buffalo Southern Han Bin (HB) groups of 19 buffalo buffalo
M. Marker;1~19. 19 buffalos of Hanbin group
2.3陕南水牛群体的多态信息含量（PIC）
PIC是等位基因频率和等位基因数的变化函数，通常用来表达微卫星座位的杂合限度。PIC不仅是衡量等位基因片段多态性的抱负指标，即可以用来表达微卫星DNA变异限度的高低，同时也关系到一个座位的可用性和效率。PIC越大，该座位杂合子的比例越大，提供的遗传信息就越高。由表2可知，4个陕南水牛群体10个位点的多态信息含量为0.7007～0.8932，平均为0.8104。
表2 4个陕南水牛群体在10个微卫星座位上的多态信息含量
Table 2 Polymorphism infomraiton content at 10 microsatellite locus of four local groups
位点
Locus
CG
NZ
NQ
HB
均值
Mean
CSSM033
0.775 4
0.756 4
0.698 5
0.774 3
0.751 2
ILSTS012
0.721 3
0.640 6
0.744 3
0.696 6
0.700 7
ILSTS031
0.827 8
0.819 0
0.815 9
0.780 5
0.810 8
ILSTS068
0.910 6
0.914 5
0.847 0
0.900 8
0.893 2
HEL13
0.853 4
0.833 8
0.855 6
0.847 0
0.847 5
ILSTS061
0.842 3
0.846 4
0.855 6
0.842 9
0.846 8
ILSTS095
0.845 7
0.836 9
0.833 9
0.814 4
0.832 7
CSSM019
0.862 4
0.872 7
0.873 3
0.843 0
0.862 9
CSSM036
0.772 2
0.725 9
0.741 2
0.751 6
0.747 7
CSSM041
0.788 2
0.739 7
0.770 3
0.773 9
0.768 0
均值
Mean
0.823 5
0.805 1
0.807 3
0.805 7
0.810 4
2.4 陕南水牛群体的等位基因数与有效等位基因数（Ne）
Ne是反映群体遗传变异大小的一个指标，一般用纯合度的倒数来表达，反映了等位基因间的互相影响。等位基因在群体中分布越均匀，有效等位基因数越接近所检测到的等位基因的绝对数。陕南水牛各群体在10个微卫星座位上的等位基因数见表3。由表3可知，ILSTS068座位的等位基因数最多，达成23个；CSSM036 座位的等位基因数最少, 只有6个; 其余座位的等位基因数为8～11个。城固、南郑、宁强和汉滨4个水牛群体10个位点的平均等位基因数依次分别为9.3，8.9，9.1和8.5个。陕南水牛总群体在10个微卫星座位上的有效等位基因数见表4。由表3和表4可知，陕南水牛各群体的有效等位基因数与检测到的等位基因数的绝对数接近限度一致，表白等位基因在各群体中分布均匀。
表3 4个陕南水牛群体在10个微卫星座位上的等位基因数
Table 3 Number of alleles at 10 microsatellite locus of 4 local buffalo populations in Shaannan
位点
Locus
CG
NZ
NQ
HB
总群体
Total population
CSSM033
7
7
8
7
9
ILSTS012
7
6
6
5
7
ILSTS031
8
8
8
7
8
ILSTS068
16
16
16
15
23
HEL13
11
10
11
11
11
ILSTS061
10
11
10
10
11
ILSTS095
10
8
9
8
11
CSSMO19
10
10
10
10
10
CSSM036
6
6
5
5
6
CSSM041
8
7
8
7
8
均值Mean
9.3
8.9
9.1
8.5
10.4

表4 4个陕南水牛群体在10个微卫星座位上的有效等位基因数
Table 4 Effective number of alleles at 10 microsatellite locus of 4 local buffalo populations in Shaannan
位点
Locus
CG
NZ
NQ
HB
总群体
Total population
CSSM033
5.052 6
4.664 0
3.668 8
5.052 6
5.069 3
ILSTS012
4.143 9
3.291 4
4.517 6
3.827 2
4.017 4
ILSTS031
6.508 5
6.227 0
6.127 7
5.120 0
6.380 1
ILSTS068
12.000 0
12.521 7
10.867 9
10.867 9
13.146 9
HEL13
7.432 3
6.697 7
7.155 3
7.200 0
7.471 4
ILSTS061
7.067 5
7.200 0
7.680 0
7.067 5
7.600 8
ILSTS095
7.200 0
6.857 1
6.736 8
6.063 2
7.314 3
CSSMO19
8.000 0
8.597 0
8.661 7
7.067 5
8.710 8
CSSM036
5.052 6
4.219 8
4.482 5
4.664 0
4.903 4
CSSM041
5.308 8
4.380 2
4.820 1
4.944 2
5.121 4
均值Mean
6.776 6
6.465 6
6.471 8
6.187 4
6.973 6
2.5 陕南水牛群体的遗传杂合度
遗传杂合度（Heterozygosity，H)是某一座位上杂合子的盼望频率，可用于衡量某座位上遗传变异量的大小。某座位上的等位基因数目越多，各等位基因频率互相越接近，则遗传杂合度值越大，说明该座位上的遗传变量越大、越丰富。平均遗传杂合度（Mean heterozygosity)是某一群体各座位遗传杂合度的算术平均值。由表5可知，4个陕南水牛群体在各位点均表现出丰富的遗传多样性。
表5 4个陕南水牛群体在10个微卫星座位上的遗传杂合度和平均遗传杂合度
Table5 heterozygosity and average terozygosity at 10 microsatellite locus of groups and total population of Shaannan buffalo
位点
Locus
遗传杂合度Heterozygosity
平均遗传杂合度
Averagehe terozygosity
CG
NZ
NQ
HB
CSSM033
0.819 1
0.802 3
0.742 9
0.819 1
0.806 9
ILSTS012
0.774 8
0.711 0
0.795 2
0.754 4
0.755 0
ILSTS031
0.864 4
0.857 3
0.854 6
0.821 8
0.847 7
ILSTS068
0.936 2
0.939 7
0.927 3
0.927 3
0.928 8
HEL13
0.883 9
0.868 8
0.878 5
0.879 4
0.870 7
ILSTS061
0.876 8
0.879 4
0.888 3
0.876 8
0.873 0
ILSTS095
0.879 4
0.872 3
0.869 7
0.852 8
0.867 8
CSSM019
0.893 6
0.902 5
0.903 4
0.876 8
0.889 8
CSSM036
0.819 1
0.779 3
0.793 4
0.802 3
0.800 2
CSSM041
0.828 9
0.788 1
0.809 4
0.814 7
0.809 0
均值Mean
0.857 6
0.840 1
0.846 3
0.842 6
0.844 9　

2.6 陕南水牛群体间的遗传距离
应用GENEPOP软件计算城固、南郑、宁强及汉滨4个陕南水牛群体的奈氏标准遗传距离，所得结果见表6。
表6　4个陕南水牛群体间的奈氏标准遗传距离
Table 6 Nei’s standard genetic distance of 4 local buffalo populations in Shaannan
群体Groups
CG
NZ
NQ
HB
CG
****
0.938 7
0.920 7
0.915 4
NZ
0.063 2
****
0.902 8
0.899 0
NQ
0.082 6
0.102 2
****
0.889 8
HB
0.088 4
0.106 4
0.116 8
****

由表6可知，城固、南郑、宁强和汉滨4个陕南水牛群体的奈氏标准遗传距离从大到小依次为宁强与汉滨(0.116 8) 、南郑与汉滨(0.106 4) 、南郑与宁强(0.102 2) 、城固与汉滨(0.088 4) 、城固与宁强(0.082 6) 及城固与南郑(0.063 2) 。
2.7 陕南水牛群体的聚类分析
采用POPGENE软件，根据遗传资料计算城固、南郑、宁强和汉滨4个陕南水牛群体在10个微卫星座位上的遗传距离,绘制UPGMA聚类图，其结果见图3。由图3可知,城固水牛群体与南郑水牛群体一方面聚在一起，然后依次同宁强、汉滨水牛群体聚在一起。
+------------------------------城固 CG
+------------1
+---2 +------------------------------南郑 NZ
! !
--3 +-------------------------------------------宁强 NQ
!
+------------------------------------------------汉滨 HB

图3 　4个陕南水牛群体间的UPGMA亲缘关系树状图
Fig.3 UPGMA dendrogram among 4 local buffalo populations in Shaannan

3 讨 论
3.1 样本的含量
样本量是实验结果可靠性的主线保证，太多则会导致不必要的浪费，太少则无法得到对的的结果。Mathur等[11]指出，应用DNA指纹标记时，每群体或品系有13～20个个体就可以获得遗传变异的合理估计值。本实验因水牛无品种之分，各地方良种水牛有共同的遗传性和生物学特性，只有在大量标记、遗传杂合度较低即品种间遗传距离较大的情况下，小样本才可接受。张继全等[12]指出，遗传距离估计精度随取样个体数的增长而提高。对此，每个群体采集48头样本，有效保证了实验结果的可靠性，特别是对发现特有等位基因具有重要意义。
3.2 等位基因和特有等位基因
本实验10个位点192个样本发现等位基因104个，特有等位基因8个，与叶鼎承[13]的报道结果（8个位点130个样本，发现等位基因78个，特有等位基因28个）相比，特有等位基因较少，表白陕南水牛各群体选育方向一致。从特有等位基因分布来看，城固群体有5个、南郑群体有2个、宁强群体有1个。各群体中只有南郑群体的2个个体在ILSTS068位点具有186 bp的特有等位基因，其余各特有等位基因均只有1个个体具有，即均为稀有等位基因。该结果表白，陕南水牛城固群体受其他地方良种水牛的影响更大，但并不影响遗传距离的测定。张继全等[12]认为，稀有等位基因对品种即遗传关系确立的奉献极小。
3.3 群体遗传多样性分析
Botstein等[14]提出了衡量基因变异限度高低的多态信息含量指标，当某位点的多态信息含量>0.5时，表白该位点为高度多态位点；当其值为0.25～0.5时，该位点为中度多态位点；当其值<0.25时为低度多态位点。本研究10个位点的多态信息含量为0.7007～0.8932，平均为0.8104，说明本研究所选的10个微卫星位点均为高度多态位点，可以用于遗传多样性的分析；同时也表白，陕南水牛多样性丰富，有很大的运用、选择潜力。此外，各位点的多态信息含量差异不大，相对较为集中，标准差为0.0614。由此可见，陕南水牛各位点相关性状均未受到强大选择压力的影响，且选择方向一致。许明[15]对中国中东部地区5个地方（峡江、海子、西林、恩施、江汉）水牛群体群体遗传多样性的研究表白，其多态信息含量为0.6425～0.6675，平均为0.6514±0.0101。刘建[16]对贵州6个地方水牛群体遗传多样性的研究显示，其多态信息含量为0.6476～0.7767，平均为0.7196±0.0270。本研究中4个陕南水牛群体的多态信息含量为0.8051～0.8235，平均0.8104±0.0088，说明与中国中东部5个地方水牛群体及贵州6个地方水牛群体遗传多样性相比，4个陕南水牛群体的遗传多样性更为丰富。此外，陕南水牛各群体多态信息含量的标准差仅为0.0088，互相之间高度接近，表白陕南水牛4个群体均未受到人工选择的强大影响，且所受到的选择压力强度基本一致。
有效等位基因数越接近于所检测到的等位基因的绝对数，表白选育限度越高，人工选择压力越大。杨国锋等[17]报道，波尔山羊为高度选育品种，其有效等位基因数和检测到的等位基因数仅相差0.68，而川东白山羊为2.66。叶鼎承[13]、许明[15]、刘健[16]分别对福安水牛、中国中东部5个地方（峡江、海子、西林、恩施、江汉）水牛群体和贵州6个地方水牛群体进行了研究，各群体检测等位基因数与有效等位基因数之差的平均值分别为2.6275，4.2838和1.5135，而本研究为各水牛群体检测到的等位基因数与有效等位基因数之差的平均值为2.5996，说明陕南水牛有效等位基因数高于贵州水牛群体而低于中国中东部5个地方水牛群体，与福安水牛的有效等位基因数基本一致。该结果表白，陕南水牛的选育限度及人工选择压力同福安水牛基本一致，但高于贵州水牛而低于中国中东部5个地方水牛群体。
本研究表白，陕南水牛各位点的遗传杂合度为0.755 0～0.928 8，平均遗传杂合度为0.8449 ± 0.0515，各位点的遗传杂合度均大于0.5，说明陕南水牛具有较高的变异度，群体近交限度弱，具有丰富的多样性。据王冬蕾[18]报道，德昌、兴隆、富钟、温州、东流、福安水牛群体的平均遗传杂合度为0.676 3～0.719 4，平均为0.689 0±0.016 3；许明[15]研究发现，中国中东部地区5个地方水牛群体的遗传杂合度为0.702 9～0.758 0，平均为0.730 4±0.025 9；刘建[16]发现贵州6个水牛群体的杂合度为0.799 9～0.745 0，平均为0.773 0±0.015 2。本研究各群体遗传杂合度为0.840 1～0.857 6，平均为0.846 7±0.003 1。由此可见，陕南水牛的变异限度高于以上各地方水牛群体。这也许是由于陕南虽位于中国水牛分布的最北部，但整体沿汉江为中轴线呈东西分布，因而受到多个地方水牛群体的影响。从地理位置上来看，其同涪陵水牛、恩施水牛、江汉水牛中心产区较为接近，但是否受到它们的影响，尚有待进一步研究。
3.4 群体间遗传距离与聚类分析
遗传距离是研究物种遗传多样性的基础，反映了所研究群体的系统发生关系，可用来描述群体的遗传结构和品种间的差异，其中Nei氏提出的标准遗传距离被广泛应用于群体遗传变异的分析。有研究者比较了几种不同的聚类方法,认为UPGMA是最为稳健的一种[19]。本研究表白，4个陕南水牛群体的遗传距离为0.0632～0.1168，这与王冬蕾[18] 对我国6个水牛群体及张毅[9]对我国18个水牛群体的研究结果相似。本研究表白，城固水牛群体与南郑水牛群体一方面聚在一起，然后依次同宁强、汉滨水牛群体聚在一起，上述聚类关系基本符合陕南水牛的地理分布格局和产区的自然环境。
本研究得到的多态信息含量、有效等位基因数及杂合度均一致表白，陕南水牛多样性丰富，选育限度较低。聚类分析表白，城固、南郑、宁强和汉滨4个陕南水牛群体之间的遗传距离基本处在同一水平,表白这4个水牛群体之间的遗传差异较小,遗传一致性限度较大。

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