HRM操作作业流程专业资料.doc

HRM应用
-10-22 10:05阅读(378)评论(0)

 高辨别率熔解曲线分析技术（ High Resolution Melting ），简称 HRM ，是近年来兴起一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测新工具，可以迅速检测出核酸片段中单碱基突变。HRM 技术因其速度快，操作简便，高通量，敏捷性特异性高，对样品无污染等长处而被迅速应用在生命科学、医学、农学、畜牧业等领域研究工作中。
1．  原理
        HRM 技术重要是基于核酸分子物理性质不同。不同核酸分子片段长短、GC 含量、GC 分布等是不同，因而任何双链 DNA 分子在加热变性时都会有自己熔解曲线形状和位置。 HRM 技术基本原理就是依照熔解曲线不同来对样品来进行区别。
        以二倍体细胞为例，当纯和子样品通过 PCR 扩增，通过变性复性后，依然是纯合子，如图一 A 。而杂合子 PCR 扩增完，通过变性复性后，样品中会形成某些具有非沃森 - 克里克配对双链分子存在。

    如图一 B 所示，杂合子样品扩增后，经变性复性，会有非配对碱基形成，而纯合子样品没有。这样，杂合子样品相对纯合子样品来说，双链不够稳定，体当前解链温度上就会有微小差别。如果采用高辨别率仪器进行检测，并用专门软件进行分析，微小差别就会被检测出来，从而成功筛选出纯合子与杂合子。
      下图是杂合子样品熔解曲线示意图：

    以二倍体细胞为例，杂合子扩增后通过变性复性会形成二种同源双链和两种异源双链混合物，在熔解过程中四种链会形成一条独特溶解曲线，从而与纯合子熔解曲线区别出来。
       下图是采用 Lightscanner 仪器对纯合子，杂合子，双杂合样品分析成果。

图三 . 采用 Lightscanner 系统对原则样品分析。灰色曲线代表是纯合子样品，红色曲线代表是杂合子样品，蓝色曲线代表是双杂合样品，通过 Lightscanner 系统分析，三种样品被明显分为了三类，体现出了极高敏捷性和精确性。
2.  应用
HRM技术可以用于如下两方面：突变筛查和基因分型。下面将详细解说这两种办法。
2.1 突变筛查
所谓突变筛查指是寻找目片段中未知SNP位点。由于杂合子与纯合子熔解温度不同，依照产生曲线形状不同判断样品也许存在SNP位点。详细如下图所示：

此办法规定是：
a：规定目片段150-400bp。
b：在PCR反映之前加入LC Green。
c：规定模板量要均一，引物特异性要好。
d：反映体系为10ul， LC Green加入量为1ul。
e：在PCR反映之前应加入矿物油25ul。
推荐反映体系下：

操作环节如下：
⑴． 配制PCR缓冲液。
⑵． 进行梯度实验。梯度实验分两步：第一步不加LC Green，拟定引物与否能用。第二步加LC  Green，拟定加染料后退火温度。普通加染料之后退火温度会高于不加染料5℃左右（取决于引物特异性）。
⑶．用优化好PCR条件扩增模板。推荐反映程序为：

⑷．双击Lightscanner图标，打开文献。点击“RUN”，设立扫描程序。将反映之后96孔板放入LS96中进行扫描。等待温度升到待机温度，将96孔板插入到机器内，注意有切角一端先插入，待门关好。点击“Start Run”，弹出一种窗口，用来储存文献。 软件对数据进行收集。

⑸． 分析成果。打开LightScanner软件：在桌面上点击LightScanner图标。打开要分析数据：  
点击“Scanning”后会弹出一种窗口，然后选取要分析数据，打开。对数据进行分组（如果不需要分组话直接进入下一步）。点击软件左上角“Subsets”，然后点击软件中部“New Subset”按钮，此时软件自动记录为第一组。在Sample Selection里选取要分入到第一组样本，然后点击软件页面下方“Add Marked to Subsets”，此时，第一组分组完毕。如果还需要分组，再点击“New Subset”按钮，此时软件自动记录为第二组，选取要分入第二组样本，点击“Add Marked to Subsets”，此时，第二组分组完毕。如果需要更多分组，重复以上操作直至分组完毕。 对样品进行命名：点击软件上方“samples”，软件右侧显示出一种表格，可以对样本进行注释或命名。如果不需要，可以直接跳过此环节。 对选定组进行分析：点击软件上面“Scanning”，软件左侧中部浮现一排操作选项，按照顺序依次点击就完毕对样品分析。一方面出来是“Negative Filter”，用来选取阴性或者阳性成果，选取好后点击“Apply Change”；然后点击“Normalize”，对曲线进行规一化；然后点击“Curve Shift”，对Shift Level进行调节，默认值为0.050，普通不需要调节；点击：“Group”，在Standards一栏下拉菜单中有“Common vs. Variants”，“Auto Group”和“Use Internal Standards”三个选项，选取适当选项后，点击“Compute Groups”即可。查看报告：点击“Report”。

2.2 基因分型
        基因分型办法有两种，一种是非标记探针法（LunaProbe法），另一种是小片段法（Small Amplicon 法）。下面将详细简介这两种办法。
2.2.1 LunaProbe法
       非标记探针法是在突变位点附近设计一非标记探针，运用不对称PCR反映，使探针序列数目足够大，从而在熔解曲线图中显示出探针峰与目片段两个峰，之后通过度析探针峰进行基因分型。

非标记探针法规定如下：
a：规定目片段不大于250bp。设计引物退火温度为60-65℃，探针退火温度65-70℃。设计探针时突变位点要处在探针中部，使错配不稳定。避免PCR过程中竞争，引物和探针不要重叠。
b：探针长度为20-35bp， 3’端封闭。C3，C5，C7封闭效果最佳，磷酸化封闭也可以接受。
c：规定DNA模板量要均一。
d：其他规定同mutation scanning。
推荐反映体系如下：（表中比例为探针与下游引物合成链互补时状况，上下引1:5）

操作环节：
⑴． 配制PCR缓冲液。
⑵． 进行梯度实验。梯度实验分两步：第一步不加LC Green，拟定引物与否能用。第二步加LC Green，拟定加染料后退火温度。普通加染料之后退火温度会高于不加染料5℃左右（取决于引物特异性）。
⑶． 拟定加染料之后退火温度，在反映中加探针，做梯度实验，拟定探针和引物与否互相抑制（PCR反映中不加探针扩增较好，加探针之后扩增不好）。如探针不影响反映，做不对称PCR，摸索适当引物浓度比。普通上下引比例为1:5或5:1时效果好，可以通过在反映中或多或少加入探针来增长或减少探针信号。大多数探针反映在探针终浓度0.20-0.25um状况下运营良好。如探针影响PCR反映，可在PCR反映之后加探针。
 ⑷．用优化好PCR条件扩增模板。推荐反映程序为：

⑸．双击Lightscanner图标，打开文献。点击“RUN”，设立扫描程序。将反映之后96孔板放入LS96中进行扫描。等待温度升到待机温度，将96孔板插入到机器内，注意有切角一端先插入，待门关好。点击“Start Run”，弹出一种窗口，用来储存文献。 软件对数据进行收集。

⑹． 分析成果 打开LightScanner软件，点击 “Genotyping”下方 “Unlabeled Probes”，打开要分析数据。分组和样本命名办法与环节和Mutation Scanning相似（省略），分组和命名完毕后，进行基因型分析：点击LightScanner软件上部“Genotyping”， 软件左侧中部浮现一排操作选项，按照顺序依次点击就可以完毕对样品分析。一方面出来是“Negative Filter”，用来选取阴性或者阳性成果，选取好后点击“Apply Change”；然后点击“Normalize”，选取要分析曲线范畴，并对对曲线进行规一化；点击：“Group”，在Standards一栏下拉菜单中有 “Auto Group”和“Use Internal Standards”两个选项，选取适当选项后，点击“Compute Groups”即可。Tm calling：在Tm calling setting表格中，Method下拉菜单中选取“Automatic mode”， Selection中选取“genotype”，Sensitivity中选取“Normal”，点击 “Computer Tm Value”即可计算出Tm值 。查看报告：点击“Report”。
2.2.2 Small Amplicon 法
        小片段基因分型是一种较好探针代替方案。由于异源双链存在，杂合子很容易检测，而这很大限度上是通过熔解曲线形状来决定。

小片段法规定：
a：规定目片段45-120bp。高低温内标要3’端封闭。
b：在PCR反映之前加入LC Green。
c：规定模板量要均一，引物特异性要好。
d：反映体系为10ul， LC Green加入量为1ul。
e：在PCR反映之前应加入矿物油25ul。
内标序列为：

 反映体系为：

操作环节：
⑴． 配制PCR缓冲液。
⑵． 进行梯度实验。梯度实验分两步：第一步不加LC Green，拟定引物与否能用。第二步加LC Green，拟定加染料后退火温度。普通加染料之后退火温度会高于不加染料5℃左右（取决于引物特异性）。
⑶．用优化好PCR条件扩增模板。推荐反映程序为：

 ⑷． 双击Lightscanner图标，打开文献。点击“RUN”，设立扫描程序。将反映之后96孔板放入LS96中进行扫描。等待温度升到待机温度，将96孔板插入到机器内，注意有切角一端先插入，待门关好。点击“Start Run”，弹出一种窗口，用来储存文献。 软件对数据进行收集。

⑸． 分析成果。打开LightScanner软件，点击 “Genotyping”下方 “Small Amplicon”，打开要分
    析数据。分组和样本命名办法与环节和Mutation Scanning相似（省略），分组和命名完毕
    后，对小分子扩增片断进行基因型分析：点击LightScanner软件上部“Genotyping” 软件左
    侧中部浮现一排操作选项，按照顺序依次点击就可以完毕对样品分析。一方面出来是
   “Negative Filter”，用来选取阴性或者阳性成果，选取好后点击“Apply Change”；Calibration:
    用来做校正，如果采用了内部校正话，按内部校正来设定，如果没有进行校正，直接进行下
   一步。然后点击“Normalize”，对曲线进行规一化；点击：“Group”，在Standards一栏下
   拉菜单中有 “Auto Group”和“Use Internal Standards”两个选项，选取适当选项后，点击
 “Compute Groups”即可。查看报告：点击“Report”。

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