共聚焦操作综合流程.docx

一、 试验环境
观察仪器是否有外表显著损坏，如需开启空调，通常控制在25度。拉上窗帘，避免标本荧光淬灭及杂光干扰。
二、 开机
查看试验统计，确定是否立即能开机（注意：汞灯必需在关机20分钟以后才能再开启，通常为30分钟）。确定后可实施以下操作：（务必先开电源，后开钥匙！！！）。
1、 打开PSU（主电源）
2、 打开激光器（只开启需使用激光器）
1） 、氩离子多线激光器（458/488/515，应用染料：GFP/FITC/Fluo3/Alexa488/CFP/YFP等）。
2） MCPSU半导体综合激光器（LD405应用染料：DAPI/Hoechst/BFP等；LD635应用染料：CY5/ Alexa647等）。
3） LD559激光器（注意：电源打开后不要立即开钥匙，等候TEMP指示灯不闪烁后，再开钥匙，红色指示灯不闪烁后，可正常使用）。
3、 打开显微镜电源IX2-UCB
4、 打开荧光汞灯（注意：开启后，“15分钟内勿关”）
5、 打开电脑主机、显示器，登陆windows xp系统，双击共聚焦软件，打开FV10-ASW应用软件。
三、 取图
1、 DIC（微分干涉差）明场立体图
（1）、插入起偏镜、检偏镜（DIC滑块）。
（2）、FV10-ASW软件中点击透射光观察按钮，打开卤素灯快门，使用TD滑块（软件TD lamp项）控制卤素灯光强，倒置显微镜下观察标本，进行标本聚焦。
1）、使用手控面板选择适宜倍率物镜下观察（注意若用60×油镜时，检偏镜部位要推上弯杆），并检验各物镜对应DIC元件。
2）、可在检偏镜部位用旋钮进行对比度调整。（需要时可使用，通常勿调）
（3）、FV10-ASW软件中点击透射光观察按钮，关闭卤素灯快门。打开DIC通道，实施取图操作。
1）、调整扫描速度至最快（2.0us/pixel），size为512by，点击 ，进行快速预扫，寻求焦平面。
步骤：合适调整HV、gain及offset参数（通常为能看到图像即可），快速调整寻求焦平面，如需放大光学倍数，可合适调整。点击，停止预扫描。
2）、选择AutoHV，放慢扫描速度（扫描速度越慢，扫描时间越长，图像信噪比好，但耗时，易淬灭，通常为10-12.5 us/pixel），size为640by，点击进行再预扫，调整HV、gain及offset参数至图象清楚尖锐即可。点击，停止预扫描。
3）、若背景噪音仍过多也可选上来降低随机噪音干扰（次数越多降噪越好，但扫描时间也越长，通常在HV较高时使用）。
4）、点击进行取图，并保留。（注意：原始图像一定要保留为oib格式）
5）、去掉，将扫描速度、size恢复至初始状态（扫描速度至最快，即最左端，2.0us/pixel，size为512by），为下一个标本做好准备。
2、荧光图
（1）、拉出检偏镜(DIC滑块)，打开汞灯机械快门（shutter）。
（2）、FV10-ASW软件中点击汞灯观察按钮，打开汞灯快门，倒置显微镜下观察标本，进行标本聚焦（找视野）。
使用手控面板，依据标本荧光探针选择适宜荧光虑色片及选择适宜物镜下观察，WU紫外激发/蓝色荧光（eg：DAPI），WB蓝色激发/绿色荧光（eg：FITC、EGFP），WG绿色激发/红色荧光(eg:Texas Red，Rhodamine，DsRed)。（通常要求标本在所用多种荧光探针匹配荧光虑色片下均能观察到所需视野，eg：DAPI＋FITC+ Texas Red多色荧光探针，需在WU,WB,WG下均能观察到所需视野，DAPI通常荧光较强，FITC或Texas Red下易找些）。（注意：更换不一样倍数物镜时应合适降低物镜再更换，以免损坏物镜；若用60×油镜时，要插入检偏镜并推上弯杆。）
（3）、FV10-ASW软件中点击汞光观察按钮，关闭汞灯快门。实施取图操作。
1）、点击，添加荧光染料。（最多为三色，多于三色需分别扫描）若标本使用荧光染料不是染料库里染料，可选激发光及发射光谱较靠近染料替换，这时可合适调整
2）、调整扫描速度至最快（2.0us/pixel），size为512by，点击 ，进行快速预扫，寻求焦平面。
步骤：合适调整HV、gain及offset参数（通常为能看到各通道图像即可），快速调整寻求焦平面，如需放大光学倍数，可合适调整。点击，停止预扫描。
3)、选上（双染以上一定要选上，可避免激发光串色），选择AutoHV （AutoHV功效为自动匹配扫描速度和HV值，不选易造成图像出现强度过饱和状态），放慢扫描速度（通常为10-12.5 us/pixel），size为640by，点击进行再预扫，调整HV、gain及offset参数至图象清楚尖锐即可。点击，停止预扫描。
4）、若背景噪音仍过多也可选上来降低随机噪音干扰（次数越多降噪越好，但扫描时间也越长，通常在HV较高时使用）。
5）、点击进行取图，保留及相关图像处理。（注意：原始图像一定要保留为oib格式）
6）、去掉，将扫描速度、size恢复至初始状态（扫描速度至最快，即最左端，2.0us/pixel，size为512by），为下一个标本做好取图准备。
四、刻录数据
图像保留后，退出FV10-ASW软件，刻录数据（注意：必需用新光盘，严禁使用U盘、移到硬盘等）。
五、关机
务必先关钥匙后关电源！！！
1、 关闭荧光汞灯（注意：开启后，“15分钟内勿关”）
2、 关闭激光器
1）、关闭LD559激光器
2）、关闭MCPSU半导体综合激光器
3）、氩离子多线激光器（注意：先关钥匙，千万别立即关闭电源，要等风扇停止转动后再关闭电源）
3、使用擦镜纸沾擦显微镜物镜（注意：通常物镜清洗液为乙醇，擦镜纸为一般擦镜纸；油镜清洗液为30％乙醇/70％乙醚，擦镜纸为olympus企业擦镜纸。），并把物镜降低到最低点。
4、关闭shutter
5、关闭显微镜电源IX2-UCB
6、等候仪器冷却后（尤其光源部分：汞灯、卤素灯、激光），盖上防尘罩（注意：激光散热风扇较热，不宜盖住）