RNA提取详细步骤及注意事项.ppt

RNA提取提取详细步步骤及注意事及注意事项目 录1 1、试剂介绍、试剂介绍2 2、主要提取流程、主要提取流程3 3、详细步骤、详细步骤4 4、注意事项、注意事项1 1、试剂介绍、试剂介绍 本实验室提取本实验室提取RNA常用的抽提剂是全式金常用的抽提剂是全式金Trizol。Trizol是一是一种新型总种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。出的核酸酶。Trizol在破碎和溶解细胞时能保持在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，因的完整性，因此对纯化此对纯化RNA及标准化及标准化RNA的生产十分有用。的生产十分有用。2 2、主要提取流程、主要提取流程磨 样加氯仿转移水相加乙醇室温晾干保 存溶解RNA测浓度胶状物加 Trizol去杂质1、剪取新鲜幼嫩叶片，置于液氮中慢慢反复研磨，直至其成为合格粉末为止。2、加入1ml Trizol，晃动3-5下，再用枪吹打2-3下，确保全部裂解。3、室温放置5分钟，使样品充分裂解。12,000g、4离心10分钟。4、每毫升 Trizol加入0.2ml氯仿，猛烈晃动15秒，室温放置2-3分钟。5、12,000g 4离心15分钟，然后吸取上层无色水相至一新的离心管中。3 3、详细步骤、详细步骤6、按1ml最初的Trizol加入0.5ml异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀10分钟。7、12,000g、4离心10分钟，弃上清，在管底可见RNA沉淀（透明胶状）。8、每毫升最初的Trizol加入1ml 75%乙醇（DEPC水配制），剧烈震荡。9、7,500g、4离心5分钟，弃上清。再用离心机甩一下（5,000rpm,离心1分钟），小心吸尽液体。10、待RNA略干后，加入20l DEPC水溶解，-80冻存。4 4、注意事项、注意事项1 1、所有离心管，枪头及相关溶液都必须无、所有离心管，枪头及相关溶液都必须无RNARNA酶污染。耐高温器物可放置酶污染。耐高温器物可放置于于150150烘烤烘烤4 4小时以去除小时以去除RNARNA酶，其它器物去除酶，其它器物去除RNARNA酶可考虑用酶可考虑用0.01%0.01%的的DEPCDEPC水浸泡过夜，然后灭菌，烘干。溶液需用水浸泡过夜，然后灭菌，烘干。溶液需用DEPCDEPC水配制。水配制。2 2、必须戴一次性口罩和一次性手套操作。尽量不要对着、必须戴一次性口罩和一次性手套操作。尽量不要对着RNARNA样品呼气或说样品呼气或说话，以防话，以防RNARNA酶污染。酶污染。3 3、提取、提取RNARNA整个过程中，尽量在低温下操作。整个过程中，尽量在低温下操作。4、在操作中当加入变性剂氯仿后，须剧烈震荡，这样才能彻底使两相混匀。5、在提取核酸时，如样品浓度低，则应增加有机溶剂沉淀时间，80下30min或20过夜将有助于增加核酸的沉淀量。6、切勿让RNA过分干燥，否则将难溶解。资料整理仅供参考,用药方面谨遵医嘱