生物化学和新生物技术省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

生物化学（第三版）生物化学（第三版）主编主编张洪渊张洪渊万海清万海清参编参编刘文彬刘文彬李永红李永红姚舜姚舜生物化学生物化学第1页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清第十五章第十五章生物化学与新生物技术生物化学与新生物技术 第2页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清基因组genome基因组是生物体内全部遗传信息集合一个物种单倍体一套染色体DNA第3页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清几个代表物种基因组大小几个代表物种基因组大小第4页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清第5页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清基因组学genomics发展和应用DNA制图、测序新技术以及计算机程序，硕士命体（包含人类）全部基因组结构及功效学科第6页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清基因组学研究最终目标基因组学研究最终目标u取得生物体全部基因组序列取得生物体全部基因组序列u判定全部基因功效判定全部基因功效u明确基因之间相互作用关系明确基因之间相互作用关系u说明基因组进化规律说明基因组进化规律第7页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清人类基因组计划科学意义在于：（1）确定人类基因组中约5万个编码基因序列及其在基因组中物理位置，研究基因产物及其功效。（2）了解转录和剪接调控元件结构与位置，从整个基因组结构宏观水平上了解基因转录与转录后调整。（3）从整体上了解染色体结构，包含各种重复序列以及非转录“框架序列”大小和组织，了解各种不一样序列在形成染色体结构、DNA复制、基因转录及表示调控中影响与作用。（4）研究空间结构对基因调整作用。有些基因表示调控序列与被调整基因从直线距离上看，似乎相距甚远，但若从整个染色体空间结构上看则恰恰处于最正确调整位置，所以，有必要从三维空间角度来研究真核基因表示调控规律。第8页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清（5）发觉与DNA复制、重组等相关序列。DNA忠实复制保障了遗传稳定性，正常重组提供了变异与进化分子基础。局部DNA推迟复制、异常重组等现象则造成疾病或者胚胎不能正常发育，所以，了解与人类DNA正常复制和重组相关序列及其改变，将对研究人类基因组遗传与进化提供主要结构上依据。（6）研究DNA突变、重排和染色体断裂等，了解疾病分子机制，包含遗传性疾病、易感性疾病、放射性疾病甚至感染性疾病引发分子病理学改变及其进程，为这些疾病诊疗、预防和治疗提供理论依据。（7）确定人类基因组中转座子、逆转座子和病毒残余序列，研究其周围序列性质。了解相关病毒基因组侵染人类基因组后影响，可能指导人类有效地利用病毒载体进行基因治疗。（8）研究染色体和个体之间多态性。这些知识可被广泛用于基因诊疗、个体识别、亲子判定、组织配型、发育进化等许多医疗、司法和人类学研究。另外，这些遗传信息还有利于研究人类历史进程、人类在地球上分布与迁移以及人类与其它物种之间比较。第9页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清HistoryoftheHumanGenomeProject1990 Official start of HGP with 3 billion$and a 15 year horizon.1999 Sanger Centre publishes chromosome 22 Draft Genome published:Celera&Public Completion(almost)of Human GenomeCelera:Craig VenterIntl.Cons:Francis Collins第10页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清第11页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清人类基因组计划HGP第12页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清全部标识都必须含有多态性因为不能对人类进行“选择性”婚配，而且人类子代个体数量有限、世代寿命较长，呈共显多态性蛋白质数量不多，等位基因数量不多。形态标识细胞学标识生化标识DNA分子标识遗传标识第13页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清第14页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清物理图物理图是指以已知核苷酸序列DNA片段为“路标”，以碱基对（bp，kb，Mb）作为基本测量单位（图距）基因组图。酵母第三号染色体遗传图酵母第三号染色体遗传图（右）和物理图（左）比较（右）和物理图（左）比较第15页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清策略用机器进行自动测序，一次可读400800个碱基，因为测定序列长度有一定限制。克隆重合群法鸟枪法第16页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清克隆重合群法v 将基因组将基因组DNADNA切割长度为切割长度为0.1Mb0.1Mb1Mb1Mb大片段，克隆大片段，克隆到到YACYAC或或BACBAC载体上载体上v 然后再进行亚克隆，分别测定单个亚克隆序列然后再进行亚克隆，分别测定单个亚克隆序列v 再装配、连接成连续再装配、连接成连续DNADNA分子。分子。v 这是一个自上而下（这是一个自上而下（up to downup to down）测序策略）测序策略 v clone-by-clone method clone-by-clone method第17页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清鸟枪法将较长基因片段打断，构建一系列随机亚克隆，然后测定每个亚克隆序列，用计算机分析以发觉重合区域，最终对大片段DNA定序。第18页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清全基因组鸟枪法测序主要步骤：全基因组鸟枪法测序主要步骤：建立高度随机、插入片段大小为建立高度随机、插入片段大小为2kb左右基因组文库。克隆数要左右基因组文库。克隆数要到达一定数量，即经末端测序克隆片段碱基总数应到达基因组到达一定数量，即经末端测序克隆片段碱基总数应到达基因组5倍倍以上。以上。高效、大规模末端测序。对文库中每一个克隆，进行两端测序高效、大规模末端测序。对文库中每一个克隆，进行两端测序序列集合。序列集合。填补缺口。有两种待填补缺口，一是没有对应模板填补缺口。有两种待填补缺口，一是没有对应模板DNA物理缺口，物理缺口，二是有模板二是有模板DNA但未测序序列缺口。但未测序序列缺口。第19页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清测序技术Sanger双脱氧链终止法Maxam-Gilbert化学修饰法高通量测序技术第20页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清高通量高通量DNA序列分析技术序列分析技术 人类基因组计划成功很大程度上得益于有效降低DNA测序成本技术更新。经过改良测序方法，不停提升其自动化程度，DNA测序成本降低了100倍，从20世纪70-80年代$10/bp降低到本世纪初$0.1/bp！假如一个熟练DNA序列分析人员采取早期80年代方法天天测定1000 bp计算，人类基因组（约3109bp）全序列分析，最少也得需要100名这么工人花上1时间才能完成。而代高通量测序仪可到达月测序1-6 Mbp！第21页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清第二代测序技术“Next Generation”Roche 454：Pyrosequencing Solexa/Illumina：cyclical base addition ABI SOLiD：sequencing by ligation第22页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清Illumina/Solexa Genome Analyzer Mb/runApplied Biosystems ABI 3730XL1 Mb/day Roche/454 Genome Sequencer FLX100 Mb/runApplied BiosystemsSOLiD3000 Mb/run第23页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清第24页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清功效基因组学功效基因组学 在完成一个生物体全部基因组测序基础上，详尽分析基因组在完成一个生物体全部基因组测序基础上，详尽分析基因组序列，判定基因组全部基因功效，描述各个基因表示和调控序列，判定基因组全部基因功效，描述各个基因表示和调控模式。模式。转录组学转录组学研究某一特殊功效状态细胞全套研究某一特殊功效状态细胞全套RNA类型与拷类型与拷贝数；比较不一样功效状态下贝数；比较不一样功效状态下RNA表示改变，搜寻与功效状表示改变，搜寻与功效状态改变紧密相关主要基因群。此研究领域惯用技术是生物芯态改变紧密相关主要基因群。此研究领域惯用技术是生物芯片技术。片技术。蛋白质组学蛋白质组学指蛋白质组研究领域，即研究某一特定状态细指蛋白质组研究领域，即研究某一特定状态细胞全套蛋白质表示谱。此研究领域惯用技术有蛋白质双向电胞全套蛋白质表示谱。此研究领域惯用技术有蛋白质双向电泳、飞行质谱、蛋白质芯片技术等。泳、飞行质谱、蛋白质芯片技术等。第25页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清转录组转录组指一个细胞内一套指一个细胞内一套RNA转录物，包含了某一环转录物，包含了某一环境条件、某一生命阶段、某一生理或病理（功效）状态境条件、某一生命阶段、某一生理或病理（功效）状态下，生命体细胞或组织所表示基因种类和水平。下，生命体细胞或组织所表示基因种类和水平。mRNA小小RNA：miRNA、siRNA蛋白质组蛋白质组指一个细胞内全套蛋白质，即研究某一特定状指一个细胞内全套蛋白质，即研究某一特定状态细胞全套蛋白质表示谱。此研究领域惯用技术有蛋白态细胞全套蛋白质表示谱。此研究领域惯用技术有蛋白质双向电泳、飞行质谱、蛋白质芯片技术等。质双向电泳、飞行质谱、蛋白质芯片技术等。与基因组不一样是，转录组、蛋白质组定义中包含了时与基因组不一样是，转录组、蛋白质组定义中包含了时间和空间限定。间和空间限定。第26页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清转录组学基本研究方法Real-time PCR基于杂交转录组学方法基因芯片基于测序转录组学方法EST全长cDNA文库SAGE第二代测序技术生物信息学分析：基因表示聚类第27页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清生物芯片在载体材料上，以大规模阵列形式排布了不一样蛋白质或核酸等生物分子，形成可与目标靶分子相互作用，并进行反应固相表面。第28页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清DNA芯片经过微阵列(Microarray)技术将高密度DNA片段阵列经过高速机器人或原位合成方式以一定次序或排列方式使其附着在固相表面，以荧光标识DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量DNA检测基因组芯片表示芯片第29页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清芯片载体玻璃片、硅片、尼龙膜、凝胶、金属对载体进行化学修饰，活化试剂经过化学反应在载体表面键合上活性基团，方便与配基结合，形成含有生物活性亲和表面，用于固定蛋白质和核酸活化试剂：EDC、NHS活性基团：氨基、环氧化物、巯基、醛基第30页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清基因芯片探针基因芯片探针寡核苷酸寡核苷酸OligocDNA：PCR产物产物 第31页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清SpottedMicroarrayscDNA ArraysOligo Arrays InSituOligoSynthesisPhotosynthesisPlanersurfaceMicrofluidicschipE-fieldsynthesisIntegratedChipsIntegrateduF,microarrayanddetectionchipswithPCR,fluorescenceore-detectionMicrofluidicsPlasticsCeramics SiliconOther materials不一样生物芯片技术平台不一样生物芯片技术平台点样芯片原位合成芯片微流体芯片整合型芯片第32页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清点样芯片点样芯片非接触式非接触式接触式接触式预先合成好探针经过类预先合成好探针经过类似于喷墨打印机技术喷似于喷墨打印机技术喷射到玻璃基片表面，或射到玻璃基片表面，或者用针头点在片基上。者用针头点在片基上。第33页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清原位合成激光照排技术光源遮蔽板芯片第34页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清array probesA 33 arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotide Deposition Sequence ACGA Mask 1AAAAA探针合成探针合成第35页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清array probesA 33 arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotide Deposition Sequence ACGC Mask 2CCCCCCAAAAA探针合成探针合成第36页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清A 33 arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotide Deposition Sequence ACGG Mask 3CCCCCCAAAAAGGGGGGCGACGACGAGCGAGCAC探针合成探针合成完成芯片完成芯片第37页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清L LT TL LL LL LC CL LL LL LL LL LL LL LL LA AC CT TT TT TA AC CC CC CC CC CC CG GC CC CG GA AT TA AT TC CA AT TC CA AT TC CG GA AC CG GA AA AC CT TA AC CT TA AG GC CA AG GC CT TT TO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PL LT TL LL LL LC CL LL LL LL LL LL LL LL LA AC CT TT TT TA AC CC CC CC CC CC CG GC CC CG GA AT TA AT TC CA AT TC CA AT TC CG GA AC CG GA AA AC CT TA AC CT TA AG GC CA AG GC CT TT TO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PL LT TL LL LL LC CL LL LL LL LL LL LL LL LA AC CT TT TT TA AC CC CC CC CC CC CG GC CC CG GA AT TA AT TC CA AT TC CA AT TC CG GA AC CG GA AA AC CT TA AC CT TA AG GC CA AG GC CT TT TO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PFor growth step:one type of monomer is coupled to specific sites deprotected using PGA.Computer generated light irradiation patterns第38页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清样本处理方法按照样本分按照样本分 DNA、RNA、DNA-蛋白复合体按照标识信号分子划分按照标识信号分子划分 荧光染料、生物素、放射性元素按照标识方法分按照标识方法分 cDNA 直接标识(间接标识)、PCR扩增标识、末端标识第39页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清芯片试验流程1、分离RNA（10g）2、标识3、杂交（预杂交）4、洗片5、扫描6、数据分析第40页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清Tagged RNA fragments flushed over arrayLaser activation of fluorescent tagsOptical scanning of hybridization intensities基因芯片杂交试验基因芯片杂交试验第41页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清图像扫描Cy5Cy3第42页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清差异基因筛选原理：采取cy3/cy5ratio值对差异基因进行判断，或采取统计方法对差异基因进行统计推断。倍数法：cy3/cy5比值大于2或者小于0.5第43页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清基因芯片应用基因表示谱分析基因发觉SNP检测药品基因组学微生物菌种判定预防医学研究第44页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清RNA-Seq转录组测序（全转录组鸟枪法测序）：利用深度测序技术对各种类型转录本进行高通量检测，取得RNA片段在特定样本中含量第45页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清定量化能够直接测定每个转录本片段序列、单核苷酸分辨率准确度，同时不存在传统微阵列杂交荧光模拟信号带来交叉反应和背景噪音问题灵敏度高，能够检测细胞中少至几个拷贝稀有转录本能够对任意物种进行全基因组分析，无需预先设计特异性探针，所以无需了解物种基因信息，能够直接对任何物种进行转录组分析，同时能够检测未知基因，发觉新转录本第46页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清蛋白质组学蛋白质组：一个细胞（或组织、机体）所表示全部蛋白质蛋白质组学：以蛋白质组为研究对象，研究细胞内全部蛋白质及其动态改变规律科学本质是在大规模水平上研究蛋白质特征：表示水平（量）翻译后修饰（成熟与调控）蛋白与蛋白相互作用（信号通路）等由此取得蛋白质水平上关于疾病发生，细胞代谢等过程整体而全方面认识 第47页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清蛋白质组学研究范围蛋白质组学研究范围蛋白质和蛋白质间相互作用蛋白质和蛋白质间相互作用蛋白质和核酸之间相互作用蛋白质和核酸之间相互作用蛋白质及其组成质点分离、分析、判定蛋白质及其组成质点分离、分析、判定蛋白质结构分析蛋白质结构分析生理、病理或不一样发育状态下蛋白质组表示差生理、病理或不一样发育状态下蛋白质组表示差异异蛋白质信息库蛋白质信息库第48页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清研究策略与技术两条互补试验流程基于凝胶工作流程基于液相色谱工作流程第49页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清双向电泳（2D）第50页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清是等电聚焦电泳和SDS-PAGE组合即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离）然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小）凝胶经染色得到二维分布蛋白质图 第51页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清第一向IPG-IEF电泳电泳固相pH梯度等电聚焦（immobilized pH gradients isoelectric focusing）IEF是一个依据样品等电点不一样而使它们在pH梯度中相互分离一个电泳技术将等电点不一样蛋白质混合物加入有pH梯度凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点对应pH位置上，形成份离蛋白质区带第52页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清第二向垂直SDS-PAGE电泳SDS-PAGE：十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，含有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。SDS与蛋白质形成雪茄状带负电荷复合物，从而消除了蛋白间电荷及形状差异，电泳速度仅与分子量相关 垂直电泳第53页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清2-DE 凝胶蛋白质斑点检测染色：1）考马斯亮兰染色法；2）银染法；3）负染法；4）荧光染色法；5）放射性同位素标识法等第54页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清2-DE 凝胶蛋白质斑点分析图像扫描和分析全自动斑点切取系统第55页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清2-DE 凝胶蛋白质斑点检测质谱使试样中各组分电离生成不一样荷质比离子，经加速电场作用，形成离子束，进入质量分析器，利用电场和磁场使发生相反速度色散，使含有同一质荷比而速度不一样离子聚焦在同一点上，不一样质荷比离子聚焦在不一样点上，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其分子量MALDI-TOF MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry）样品溶于固定底物中形成晶体，用激光脉冲使其离子化，离子被加速后经过飞行管时分离，全部离子均可被检测第56页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清蛋白质芯片将蛋白质固定在固相载体上，经过大分子之间特异性识别和结合进行检测。酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子第57页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清蛋白质芯片探针低密度蛋白质芯片：直接点样高密度蛋白质芯片：cDNA文库所产生几乎全部蛋白质均呈微距阵排列，点样时须用机械手进行第58页生物化学生物化学主编主编 张洪渊张洪渊 万海清万海清应用蛋白质表示谱分析蛋白质与蛋白质相互作用DNA蛋白质、RNA蛋白质相互作用筛选药品作用蛋白靶点药品筛选第59页