菌种保存传代使用销毁管理作业规程操作作业规程.doc

菌种管理制度
1、目 建立菌种保存、传代、使用、销毁原则操作规程，规范微生物学检定用菌种管理，最大限度减少变异率，保证菌种溯源性与稳定性，从而保证微生物学检查成果精确可靠。
2、合用范畴 本规程合用于检定用菌种管理，涉及菌种购买、保存、传代、使用及销毁等。
3、定义
Ø 原则菌株是指由中华人民共和国药物生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供冷冻干燥菌。
Ø 传代用菌种是指用原则菌株制备采用特定保存办法长期固定保存菌种，用于传代及制备工作用菌种。
Ø 工作用菌种是指用原则菌株或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为寻常工作使用菌种。
Ø 菌种代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得冷冻干燥菌种为第0代。
4、职责
4.1部门主管负责菌种申购、接受、保存分发。
4.2微生物检查员负责菌种确认、传代、使用及销毁。
5、规程
5.1菌种申购
部门主管依照菌种使用状况，提出年度购买筹划（涉及暂时检查需要），填写申购流程，经审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（原则菌株）或传代用菌种，购买时，需拟定菌种代数，以便控制传代代数。
5.2菌种接受
菌种到达实验室后，由部门主管接受菌种，检查其名称和数量，以及每一支完整性，同步将菌种所有信息，填写在《原则菌株库存记录》上，内容涉及：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种编号原则编号）、代数、来源、接受日期、接受人等，并将其暂贮存于4～8℃冰箱中，在一周内必要完毕转种。
5.3菌种保存
5.3.1工作用菌种保存
工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适当琼脂斜面培养基上，待菌生长充分后来，转移至4～8℃冰箱中保存。此法仅用于工作用菌种短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等状况，发现异常状况，经应灭活解决后销毁。保存时间依照菌种种类而不同，细菌：每月转种一次；酵母菌及芽胞：3~6个月转种一次；丝状真菌每年转种一次。
5.3.2传代用菌种保存
采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡保存法。
5.3.2.1甘油冷冻管保存法
用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面菌苔，并通过接种环与试管壁之间轻轻摩擦而使细菌充分扩散到预先装入试管中无菌纯化水中，调节菌液浓度，使其等同于10号比浊管，向已制备好菌悬液中加入等体积无菌甘油（浓度20%），即为10%甘油菌悬液，轻轻振摇，使内容物充分混合，分装于无菌小试管，在-30℃冷冻条件下保存。此甘油冷冻管为第2代（G2）。可以每隔2年转种一代。使用时，取出一支放至室温，转种增菌培养或接种至琼脂斜面复苏，挑取纯菌落传代或工作用。此种办法重要合用于需氧细菌和酵母菌保藏（如大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌）。
5.3.2.2液体石蜡保存法
5.3.2.2.1无菌液体石蜡制备：选用优质化学纯液体石蜡，将液体石蜡分装加塞，用牛皮纸包好，在121℃灭菌30分钟,置40℃恒温箱中蒸发水分，经无菌检查后备用。
5.3.2.2.2液体石蜡管制备：将菌种穿刺接种于半固体高层培养基中，在适当条件下培养结束后，在层流台下用无菌吸管吸取上述无菌液体石蜡至培养好菌种管内，并使石蜡高出菌种表面约1cm使菌体与空气隔绝，并将试管直立，置于-20℃冷冻或2～8℃冰箱中保存。此法重要合用于霉菌、厌氧菌、放线菌、芽孢杆菌保存（如枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌等）。
5.3.3各菌种保存办法、条件及期限，见下表1
表1 传代用菌种保存办法、保存温度、保存期限
菌种名称
保存办法
保存温度
保存期限
大肠埃希菌〔CMCC(B)44102〕
甘油冷冻管
-30℃
2年
金黄色葡萄球菌〔CMCC(B)26003〕
铜绿假单胞菌（CMCC（B）10104）
枯草芽孢杆菌〔CMCC(B)63501〕
乙型副伤寒沙门菌〔CMCC(B)50094〕
白色念珠菌〔CMCC(F)98001〕
液体石蜡管
2-8℃
1年
黑曲霉菌〔CMCC(F)98003
5.4菌种解决和保藏
5.4.1原则菌株复苏、确认、传代
5.4.1.1原则菌株复苏
5.4.1.1.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球。
5.4.1.1.2培养基
Ø 改良马丁琼脂培养基：用于黑曲霉复苏、复壮；
Ø 液体硫乙醇酸盐培养基：用于生孢梭菌复苏、复壮；
Ø 营养肉汤培养基：用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮；
Ø 改良马丁培养基：用于白色念珠菌复苏、复壮
5.4.1.1.3原则菌株复苏操作环节：
如下操作均在生物安全柜内进行。
a) 在安瓿外表面用75%酒精擦拭并让其自然风干。
b) 用一小砂轮在安瓿上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（启动安瓿时必要小心，由于安瓿遇热时也许会破裂）。
c) 以无菌办法用一无菌吸管从已准备好上述液体培养基中移取0.5～0.8 ml到安瓿中。
d) 轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。
e) 用无菌吸管将安瓿内菌液所有转接到相应液体培养基。
f) 依照安瓿上所标明不同菌种类型而将其培养于相应温度（细菌培养温度30～35℃，培养18～24小时；真菌培养温度23～28℃，培养3～5天。观测与否浑浊，浑浊阐明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌解决。
g) 若黑曲霉为菌悬液，则先放置室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体1～2滴滴在改良马丁琼脂斜面上，用吸管涂布均匀，置23～28℃培养5～7天，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色，斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。确认后用具有0.05%（ml/ml）吐温-800.9%无菌氯化钠溶液洗脱到无菌试管中。
h) 取经复苏后上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按f）项操作对菌种进行复壮。以无菌技术向复壮后菌种中加入100ml20%无菌甘油混匀，1~2ml/管，分装于冻存管。每个菌种制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应确认，别的作为储备管在-30℃冷冻条件下保存。黑曲霉按g）项下办法进行复壮，制成复壮后孢子悬液20ml。以无菌技术向复壮后菌种菌悬液中1~2ml/管加石蜡高出菌种表面约1cm使菌体与空气隔绝，并将试管直立，封存于冻存管，置于-20℃冷冻或2～8℃冰箱中保存。制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应确认。别的作为储备管。将上述制备好冻存管逐支粘贴标签。内容涉及：菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。
i) 储备菌种管制备成功，储存于－30℃，有效期为两年。
5.4.1.2原则菌株确认
a) 用无菌接种环取上述培养物接种到胰酪大豆胨琼脂（TSA）培养基（细菌）或沙氏葡萄糖琼脂培养基（真菌和酵母菌）平板上，或相应宜于该菌生长鉴别培养基平板上。
b) 然后在30～35℃下培养3天（细菌）；20～25℃下培养5天（真菌和酵母菌）。
c) 培养后，一方面观测其与否具备典型菌落形态，然后挑取生长旺盛单一纯菌落，划线于平皿培养基，每种菌划4个平皿，以便收集较多生长旺盛典型单菌落，进行保存和鉴定。
d) 鉴定期作革兰氏染色、镜检，观测其染色特性及形态特性。必要时再做生化实验以进一步鉴定该菌种。
e)  若在该平板上发既有其他菌落生长，则阐明操作有污染或菌种不纯，应将此被污染了培养物灭活解决，并寻找因素。应依照其因素采用办法重新分离挑选纯菌落。
f) 菌种确认成果，记录在《菌种鉴定记录》上。
g) 各菌种复活、划线用培养基、培养条件，见《菌种复活、划线用培养基、培养条件》（附件2）。
5.4.1.3菌种传代
5.4.1.3.1原则菌株传代
a) 按菌种阐明书规定复溶菌粉，转种于适当增菌培养基内，称第1代（G1），复壮后转接至平板上，并在恰当温度下培养恰当时间，分离单个纯种菌落，此为第2代（G2）。
b) 菌种确认后，挑取平板上纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管或液体石蜡管，作为保存菌种（G2），也称传代用菌种，同步挑取纯菌落转接斜面菌种数支，作为工作用菌种，此为第3代（W3）。
c) 将第2代（G2）菌种管冷冻保存，将工作用菌（W3）于恰当温度下培养恰当时间后用于寻常检查。
d) 取一支冷冻保存第2代（G2）菌种转种于平板和斜面培养基上。平板上菌种制成冷冻保存管第3代（G3）；斜面培养基菌种经恰当温度下培养恰当时间后用作工作用菌种，此仍为第3代（W3）。
e) 将第3代菌种（G3）冷冻或低温保存，将生长、转种后第2代（G2）菌种经高温灭活解决后丢弃。
f) 按上述规程操作，直至G4转为W5为止，需重新启动冷冻干燥菌种，重复上述规程操作，保存和使用菌种。
g) 当工作用菌种代数不大于5时，在规定保存期限内，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种。
5.4.1.3.2传代用菌传代
将购回无异常传代用菌种（普通为第3代），依照寻常检查工作需要量，挑取纯菌落转接斜面菌种数支，作为工作用菌种(为第4代)，同步，结合菌种代数和最长保存期限，挑取纯菌落制成浓菌悬液按“5.3.2．”办法制备甘油冷冻管或液体石蜡管数支，作为传代用菌种（仍为第3代）。
5.4.1.3.2.1传代用菌传代操作环节
Ø 从冰箱冷藏室（2~8℃）中取出菌种斜面后，应温室放置约30min。
Ø 将装有新鲜配制培养基和传代菌种一并移入生物安全柜内，打开紫外灯照射1小时。
Ø 关闭紫外灯。酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口接近火焰上方，右手拿接种环，将接种环烧红约30s，
5.4.1.3.2工作用菌种传代
当工作用菌种代数不大于5时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种。
取在冰箱4～8℃保存工作用菌种用普通琼脂斜面传代，并将新传代培养物代替原有菌种，作为工作用菌种。也可取用“甘油冷冻管保藏法或液体石蜡覆盖保藏法”保存菌种，进行复苏，直接作为工作用菌种。细菌每1个月传代一次；酵母菌每2个月传代一次；霉菌及芽胞每3个月传代一次。当超过5代，须用传代用菌种传代。
5.4.4注意事项：
传代时注意无菌操作，使菌株不死亡，不污染、不丢失。同步实验人员也要采用有效防止办法进行自我保护，如工作时必要穿工作服，佩带无菌手套，实验完毕后来消毒实验进行区域、实验仪器和器具。如发生意外，如菌种泄漏或人员受伤，微生物学检查人员应及时向部门主管报告以便及时进行解决。
5.4.5传代后，按检定菌种编号原则编号，并在每一支菌种管上贴上标签，标签内容涉及：名称、编号、代数、传代日期、操作人、有效期。交部门主管统一保管。同步及时填写《菌种传代记录》（附表2）。
5.5检定菌种编号
采用字母加数字表达：英文缩写字母—代次—传代日期—顺序号 
菌种英文缩写字母：大肠埃希菌（E.c）、金黄色葡萄球菌（S.a）、枯草芽孢杆菌（B.s）、白色念珠菌（C.a）、黑曲霉菌（A.n）、乙型副伤寒沙门菌（S.p）代数用一位带有下标数字字母表达：传代用菌种用G表达；工作用菌种用W表达；如G3表达传代用菌种第3代；W3表达工作用菌种第3代。
传代日期用6位数字表达：年份取最后两位数，月、日分别用两位数。如：1月12日传代第一支大肠埃希菌作为传代用菌种编号为E.c-G3-12-01。
5.6检定菌种保管
5.6.1检定菌种设专人加双锁保管，并对所保存菌种建立《检定菌种保存、领用登记台账》（附表3）。
5.6.2检定菌种定期检查与鉴定
在菌种保存期间，工作日应每天检查保存菌种冰箱温度、必要时检查菌种管塞子与否松动，与否染杂菌等，并及时填写《检定菌种观测记录》（附表4），如有异常应及时解决。菌种在保存期内均应依照菌种特性（工作用菌种每转种两代一次、传代用菌种每三个月一次）检查其菌落性状、革兰染色、显微镜下菌体形态，必要时检查生化特性等项目，若发现与原菌种变异较大，应重新分离、纯化、鉴定、再加以保存，并做好《检定菌种鉴定记录》（附表5）。
5.6.3所保管菌种，不能随意转让其她单位和个人，需要时应有单位证明和批准手续方可供应。
5.7检定菌种使用
5.7.1微生物学检查人员依照检查需要，需到部门主管领取工作用菌种或传代用菌种，同步填写《检定菌种保存、领用登记台账》。
5.7.2微生物学检查人员从部门主管领取工作用菌种或传代用菌种，用于寻常检查或验证明验，使用后及时填写《检定菌种使用登记台账》（附表6），以便追踪菌种使用历史。
5.7.3菌液制备：将新鲜斜面菌种培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10-100cfu/ml菌悬液，置于0～4℃冰箱冷藏，用于阳性对照实验，有效期24h，浓菌液放冰箱可保存一周。
5.8．检定菌种（废弃）销毁
5.8.1下列状况菌种或培养物或被污染器具等，必要采用121℃、45分钟湿热灭活解决：
a、新一代菌种制备成功后上一代菌种；
b、使用完后菌种和带有原则菌株器具和培养物；
c、超过有效期菌种；
d、凡被污染、变异、可疑等异常状况菌种；
e、其她应废弃菌种。
5.8.2废弃菌种销毁由微生物检查员提出申请，交部门主管批准后，进行灭活解决，并有其她人在场监督，并填写《废弃菌种（物品）销毁解决记录》（附表7）。
6、有关文献：
《初始污染菌检查原则操作规程》、《纯化水检测原则操作规程》、《中华人民共和国药典原则操作规程》等。
7、注意事项：
8.1、微生物检查人员最佳生物有关专业，要通过培训，取证上岗。
8.2、购买菌种要保存有关证明，最佳让药检所开个证明，阐明购买菌种名称、菌种代数、数量等，把这个证明附在《菌种接受记录》后。
8.3、菌种传代、使用在阳性操作间，为保护菌种和人员，最佳使用生物安全柜。
8.4、菌种惯用是10-100cfu/ml菌悬液，可依照预实验，拟定制备办法。
如果是细菌：可参照麦氏原则管进行估算。
从孵育18-24小时非选取性培养基上，挑取3-5个菌落，直接用肉汤或盐制成悬液作为接种，普通将浊度调节至麦氏比浊原则管10号相应浓度，然后稀释。

麦氏比浊管配制办法：
0.048MBaCL2(1.17%W/VBaCL2 2H2O) 、0.36NH2SO4(1%V/V)
将二液混合，置螺口试管中，放室温暗处保存，用前混匀。有效期为6个月。应用时，可目测或使用比浊仪即可。
0号管相应菌浓度为30×108
cfu/ml，稀释普通用无菌生理盐水（0.9%氯化钠溶液）。
8、附表
附表1：《检定菌接受记录》
附表2：《检定菌种传代记录》
附表3：《检定菌种保存、领用登记台账》
附表4：《检定菌种观测记录》
附表5：《检定菌种鉴定记录》
附表6：《检定菌种使用登记台账》 
附表7：《废弃菌种（物品）销毁解决记录》
附表1：《检定菌接受记录》：

鉴定菌种接受记录
文献编号：BJ-QR-WJ013-A1
接受
日期
名称及编号
数量
代数
来源
检查状况
保存条件
接受人

备注：

附表2：《检定菌种传代记录》
检定菌种传代记录
文献编号：BJ-QR-WJ013-A1
名称及编号

传代日期

传代前菌种保存办法

传代数量

其中
传代用菌种
数量
编号
传代用培养基

工作用菌种
数量
编号
传代用培养基

操作过程：
操作人： 复核人：

附表3：《检定菌种保存、领用登记台账》
检定菌种保存、领用登记台账
文献编号：BJ-QR-WJ013-A1
名称及编号

传代日期

传代前菌种保存办法

传代数量

其中
传代用菌种
数量
编号
传代用培养基

工作用菌种
数量
编号
传代用培养基

操作过程：
接受人/日期： 移送人/日期：
领取
领取日期
名称及编号
数量
用途
领取人
发放人

剩余数量
传代菌种共发放 ，应剩余 ，实查 。
工作菌种共发放 ，应剩余 ，实查 。
接受人/日期： 移送人/日期：
备注：

附表4：《检定菌种观测记录》
日期
冰箱温度（℃）
塞子与否松动
与否染菌
解决办法
记录人

备注：

附表5：《检定菌种鉴定记录》
检定菌种鉴定记录
文献编号：BJ-QR-WJ013-A1
菌种名称及编号

开始鉴定日期

鉴定因素

【鉴定项目】
菌落形态
革兰染色
显微镜下形态
典型生化特性
鉴定成果：
操作人： 复核人： 年 月 日

附表6：《检定菌种使用登记台账》
检定菌种使用登记台账
文献编号：BJ-QR-WJ013-A1
领用日期
名称及编号
数量
使用人
所检产品批号

备注：

附表7：《废弃菌种（物品）销毁记录》
废弃菌种（物品）销毁记录
文献编号：BJ-QR-WJ013-A1
日期
被解决菌种（物品）名
销毁因素
解决方式
销毁人
销毁监督人

备注：废弃菌种要标明编号、数量（支）

起草人：
审核人：
批准人：