HPLC改善峰形专项方案.doc

三、峰形问题

    峰形对称性优劣对峰面积和分离度有很大影响，从而影响分析结果正确性。引发峰形异常原因很多，柱外死体积引发峰形异常有个特点：对先出峰影响大，对后出峰影响小；柱头塌陷、柱头和筛板污染会引发全部峰形全部异常，而硅醇基次级保留只引发部分峰拖尾。相塌陷除了引发保留下降外，也会造成峰拖尾。色谱实践中，大部分峰形问题全部不是色谱柱问题，仪器参数设定、色谱条件和方法正确是否对峰形有很大影响。
1.  峰后拖
常见3种拖尾情况：

次级保留引发峰拖尾机了解析：
反相色谱中，通常非极性和弱极性化合物能取得良好峰形，而带有－COOH、－NH2、－NHR、－NR2等极性基团化合物则比较轻易产生拖尾，原因是硅胶表面残留硅羟基对极性和碱性样品分子产生次级保留效应。

    反相填料表面有残余硅羟基，含有一定酸性，其pKa约为4.5～4.7。依据电离规律，流动相pH－pKa>2即pH>6.7时，99％以上硅羟基应该是呈离子状态，即Si－O－ ，而pKa－pH>2即pH<2.5时，酸性环境抑制了硅羟基电离，99％以上硅羟基应该是呈分子状态，即Si－OH，但其极性仍然存在，即Si－Oδ－Hδ＋。Si－Oδ－Hδ＋和－Si－O－对于极性化合物之间作用力则是一个极性静电作用力，这种作用力比范德华力要强得多。同时，因为硅胶表面键合了C18长链，因为空间位阻作用，样品分子中能接触到残余硅羟基机会不多，只有少部分分子才能和残余硅羟基产生强静电作用而被推迟洗脱出来，产生后拖。拖尾严重程度和样品分子极性大小和残余硅羟基多少有着直接关系。

    上图是填料表面示意图，完全硅羟化硅胶表面硅羟基浓度为8?mol/m2，因为空间位阻作用，通常和C18硅烷基发生反应仅达2～3.5?mol/m2，需要再用小分子硅烷跟硅羟基反应，图中三甲基氯硅烷，使硅羟基中氢变成了三甲基硅烷一个惰性基团。三甲基硅烷还是比氢原子大得多，还是不能将全部残余硅羟基活性封闭掉。
    相同样品在不一样品牌柱子上产生拖尾严重性不一样，从填料合成角度而言就是键合密度是否高、封尾是否根本，高密键合和根本封尾能显著降低这种机会，取得良好峰形。Welch企业Ulimate品牌XB－C18、AQ－C18和Xtimate C18采取就是高密键合和根本双峰尾工艺。

处理方案：
1）先检验样品是否过载，因为样品过载引发峰形后拖不能经过改变色谱条件消除。假如发觉过载，需降低进样量（包含进样体积或浓度），进样量越小，峰形越好，例子如头孢尼西钠测定：

2）调整流动相pH
将流动相pH调至比弱酸pKa小2以上，比弱碱pKa大2以上，可有效抑制易离子化待测物电离，从而取得良好峰形。例子如二甲基苯氧乙酸测定：

    碱性化合物中，甲胺pKa为10.64，那么在pH< 8.64时候它是完全呈离子态， 那么pH在2.5~8.64时，尤其是pH6.7～8.64时，此时甲胺和硅羟基均以离子状态－NH3＋和Si－O－形式存在，它们之间相互吸引静电作用造成后拖，这就是为何很多碱性化合物在pH 7.0条件下轻易产生拖尾原因。而很多色谱柱生产商也所以以阿米替林（含－N(CH3)2，碱性比－NH2强）在pH 7.0条件下来评价和比较不一样色谱柱之间优劣，该条件下阿米替林峰形越好说明封尾越好。而在pH<2.5条件下，也仍然后拖，是因为－NH3＋足够强，即使硅羟基以分子状态存在也仍能够和Si－Oδ－Hδ＋中氧原子产生吸引作用，造成峰形拖尾。当pH>12.64，大于pKa2以上时，甲胺完全以分子状态形式存在，不会引发拖尾。

3）增加缓冲盐或增大缓冲盐浓度：
    流动相中加入缓冲盐，增强了流动相离子强度，在－NH3＋等极性基团和硅羟基Si－O－之间存在着很多离子干扰，降低了样品分子和硅羟基之间相互接触机会，有利于减弱极性基团和硅羟基之间相互作用，改善峰形。这种适合于碱性较弱（如氨基N原子和强吸电子基相连），或碱性很强，但在刚性结构中，比较难以靠近被C18长链和封尾试剂覆盖硅羟基，例子如高乌甲素测定：

4）加入三乙胺、四丁基硫酸氢铵或辛烷磺酸钠等
    拖尾产生是因为－NH2、－NHR、－NR2和硅羟基发生静电作用引发，那么阻碍它们之间静电作用路径，应该有两种，一个是占据硅羟基这个作用位点，另一个是占据－NH2、－NHR、－NR2这个作用位点。 
    在流动相中加入三乙胺，能显著改善峰形，消除拖尾，其作用是屏蔽硅羟基。三乙胺pKa为11.09，在pH<11.09－2＝9.09条件下是以离子状态N＋H(CH2CH3)3形式存在，所以pH在2.5~8.64 硅羟基呈Si－O－离子态情况下，N＋H(CH2CH3)3轻易和Si－O－形成相对较强静电吸引力。
    加入三乙胺改善峰形时候，有两点需要注意：1）三乙胺碱性很强，加入三乙胺后流动相pH可能超出色谱柱使用范围，对色谱柱造成损伤。pH改变也会造成出峰时间显著改变，可能引发其它问题，提议流动相中加入三乙胺后回调至未加入前pH值。通常即使pH回调过后，因为三乙胺成为了固定相一部分，保留时间也有较大改变；2）三乙胺在210nm处有比较强吸收，假如液相方法中检测波长在210nm以下测定时需要谨慎使用。
    四烷基季铵盐（如四丁基硫酸氢铵、四丁基溴化铵、四丁基氢氧化铵等）在水中电离后，也形成了类似N＋H(CH2CH3)3结构N＋(CH2CH2CH2CH3)4 ，这种结构也能有效和Si－O－产生较强静电作用，阻止氨基和硅羟基接触，改善峰形。而且它还有一个不一样于三乙胺显著特点是，它在低波长范围吸收比三乙胺弱。
    流动相中加入辛烷磺酸钠等烷基磺酸盐离子对试剂也能很好改善峰形，其作用机理和三乙胺和四丁基硫酸氢铵颇为不一样，是经过和样品分子作用来阻止样品分子和硅羟基作用来改善峰形。
2．峰前延
峰前延发生概率比较小，下面是三种前拖峰表现形式：

    造成前延峰原因有多个，我们可依次逐一排查：
1）样品是否过载
    降低进样浓度，看峰形是否有所改善。通常认为峰高在100mAU左右比较适宜，不至于因过载影响峰形。
2) 检验是否是用流动相溶解样品
    溶解样品溶剂（如纯甲醇）洗脱能力比流动相强会发生峰前延。具体机理是：
    正常峰形应该是样品在色谱柱上均匀前移情况下得到，浓度分布在整个经过色谱柱柱床过程中任何时候全部呈正态分布。样品溶液进样后抵达色谱柱时间很短，应还未被流动相充足稀释，洗脱能力更强样品溶剂局部存在，将使部分样品被洗脱速度加紧，造成峰前延。

3）增加流动相中缓冲盐浓度
    增加缓冲盐浓度能够增大流动相中离子强度，降低因静电作用（有可能存在于样品分子之间、也有可能存在于样品分子和填料表面之间）引发前延。比如：注射用苦参碱测定

4）流动相中加入适量四氢呋喃
    往流动相中加入少许四氢呋喃有时能够改善峰形、增大分离度，很多色谱工作者全部知道和使用，但其机理似乎少人提及。通常所加入量在5％以内即可，需要时候能够加入更大量。例子以下：

阿莫西林胶囊测定
色谱柱：Ultimate AQ－C18，5um，4.6×250mm；                                                
检测波长：254nm；        温度：室温28度；                          
流  速：1.0ml/min；       进样量：20ul；

5）升高柱温
    升温有利于增加流动相传质速率，降低因静电作用引发前拖，但温度不宜太高，温度太高轻易损伤色谱柱，尤其是含有离子对试剂时候，最好不要超出40度。

3．其它峰形问题
裂峰：

    柱头污染和柱头塌陷全部会造成裂峰，最常见原因是筛板上颗粒物堵塞样品进入色谱柱不均一，只需反冲色谱柱将颗粒物除掉就可处理。