降解酒糟生物质的纤维素分解细菌的筛选及产酶研究.doc

本科毕业论文（设计）

论文（设计）题目：降解酒糟生物质的纤维素分解细菌的筛选及产酶研究

学 院： 农 学 院 ＿
专 业： 农业资源与环境
班 级：＿09 农 资＿ ＿
学 号：＿0909010165 ＿
学生姓名：＿ ＿ ＿＿
指导教师：＿ ＿

2013年 5 月 28 日

贵州大学本科毕业论文（设计）
诚信责任书

本人郑重声明：本人所呈交的毕业论文（设计），是在导师的指导下独立进行研究所完成。毕业论文（设计）中凡引用他人已经发表或未发表的成果、数据、观点等，均已明确注明出处。
特此声明。

论文（设计）作者签名：

日 期：

III
贵 贵州大学本科毕业论文（设计）
目 录
摘 要 II
Abstract III
1前言 1
1.1研究意义及目的 1
1.2纤维素分解细菌的简介 1
1.3国内外研究概况 2
2材料与方法 3
2.1供试样地区域概况 3
2.2样品基本理化性质 3
2.3研究内容和技术路线 4
2.3.1主要研究内容 4
2.3.2技术路线图 4
2.4培养基 5
2.5主要试剂和仪器 5
2.5.1试剂 5
2.5.2主要仪器 6
2.6方法 7
2.6.1分离、纯化 7
2.6.2细菌初筛 7
2.6.3细菌生长曲线的测定 7
2.6.4纤维素分解细菌的复筛 8
3结果与分析 10
3.1分离、纯化结果 10
3.2菌株初筛结果 10
3.2.1初筛情况统计 10
3.2.2初筛的保存 12
3.3细菌生长曲线测定结果 12
3.4纤维素分解细菌的复筛结果 13
3.5滤纸条崩解实验 15
4结果与讨论 17
参考文献 19
致 谢 20

降解酒糟生物质的纤维素分解细菌的筛选及产酶研究
摘 要
本试验从茅台酒厂提供的样品中分别从30℃和50℃下分离出能分解利用羧甲基纤维素（CMC-Na）的细菌共244株。经革兰氏碘液染色，在CMC-Na培养基上生成透明圈与菌落半径的比值大于5.0的有103株，大于10.0的有12株，其中，菌株BL5-95的透明圈与菌落半径比值最大，达到15.0。在这103株菌中，产透明圈半径大于1.5 cm（30℃）和2.0 cm（50℃）的菌株有20株。本试验分别从50°C和30℃培养筛选条件下选取7株和6株，对这些菌株进行纤维素酶活及其他各项指标的测定。
菌株的生长曲线试验分别在30℃（中温）条件下静置培养和50℃（高温）条件下振荡进行培养。通过不同温度分离筛选条件下得到的菌株分别在其对应温度下的生长曲线可以看出，高温振荡培养的菌株会在试管表面长出菌苔，菌液澄清，试管底部有沉淀；中温静置培养条件下的菌株菌液整体浑浊，分布均匀。高温振荡培养的菌株在培养前期（12 h）生长快于低温静置培养的菌株，但培养3 d后，二者生长趋势趋向一致，但中温条件下筛选的部分菌株（BL5-106）性能优于高温条件下筛选得到的菌株。
通过纤维素酶活力鉴定，菌株BL5-106的酶活力最高，达到93.87 U/mL，表明该菌株最具研究价值，该探究也为下一阶段的堆肥试验提供了前期准备及研究用菌。

关键词：纤维素分解细菌，酶活性，纤维素酶，筛选

Screening of Vinasse Cellulose Decomposing Bacteria and Research on Enzyme Production
Abstract
244 bacteria strains which could form a sharp and distinct zone around the cellulase-producing microbial colonies on carboxymethylcellulose (CMC) plates with Gram’s iodine had been isolated. There were 103 strains which the radius ratio of distinct zone and colony was more than 5.0, and among which, the radius ratio was more than 10.0 were 12 strains. Especially, the radius ratio of strain BL5-95 was the highest (15.0). The strain number which the radius of distinct zone was more than 1.5 cm under 30℃ and more than 2.0 cm under 50℃ conditions was 20. In this study, 7 strains from 50℃ conditions and 6 strains from 30℃ conditions had been chosen to assay the active of cellulases and other index.
The growth curve of strains test were cultured under 30℃ static culture and 50℃ oscillation conditions, respectively. There were lawns appearing on the culture medium surface, and the liquid were clarification under oscillation conditions. However, there was precipitation in the bottom of the test tube. In contrast, the liquid were overall turbidity under static conditions. Strains cultured under 50℃ oscillation conditions grew faster than the strains from 30℃ conditions during the earlier incubation stage, however, the growth from different conditions were consistency after incubation 3 d. The performance of strain BL5-1-6 from 30℃ conditions was better than the strains from 50℃ conditions.
The cellulose active of BL5-106 was the highest, which was 93.87 U/mL. This study provides preparation and microbes for the composting experiment.

Keywords: cellulose decomposing bacteria, enzymatic activity, cellulase activity, screening

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1前言
1.1研究意义及目的
酒糟是酿酒业最主要的副产物，在我国，每年白酒酒糟产量都在2500万t以上[1]。由于酒糟酸度偏大，可生化性较较强，极易腐烂，不便存储，若不及时处理，易对环境造成极大的污染[2]。
酒糟生物质主要由纤维素和木质素构成，同时含有一定的残余糖分、淀粉、粗脂肪和蛋白质[3]，因此，可利用具有降解纤维素的菌种对其进行分解，把其中部分纤维素转化为有机质等，从而提高酒糟的综合利用效率[4]。
对纤维素酶产生菌的研究过去多集中于真菌的研究和应用，鉴于细菌繁殖和产酶速度快、发酵周期短，有利于工业生产，故近年来对细菌产纤维素酶日益引起重视。纤维素酶的比活力一般都很低，因而产酶成本高。据估计，纤维素水解成葡萄糖所需的酶蛋白要比淀粉相应水解所需的酶蛋白多100倍，这是影响纤维素酶实际应用的重要原因之一[5]。因而，筛选纤维素酶比活力高的菌株无疑具有重要的意义。
本试验针对酒糟生物质降解慢的难题，拟从茅台酒厂提供的样品中分离细菌，筛选出酶活性较高的纤维素细菌菌株，对筛选的菌株进行产酶特性初步研究，以此为依据优化产酶条件，以期为酒糟综合利用研究提供科学依据。
1.2纤维素分解细菌的简介
能产纤维素酶的细菌种类虽不如真菌，生孢食纤维菌属( Sporocytophaga ) 、有报道的食纤维菌( Cytophaga) 、多囊纤维菌属( Polyangiumcellulosum) 等属细菌均有较强分解纤维素的能力[6] 。
酶活较强的菌种有纤维杆菌属(Culmolnoas)、生孢纤维菌属(sporocytophaga)[7]和梭菌属(cellulomonas)。研究最多的是纤维单胞菌（Cellulomonas）[8-9]和热纤梭菌（Clostridium thermocellum）。根据细菌的生理学特性，一般将纤维素降解细菌分类为：厌氧型、好氧型和好氧滑动菌。好氧细菌以可溶性胞外酶的形式分泌出3种纤维素酶对纤维素进行水解， 如纤维杆菌属(Culmolnoas)的纤维单胞菌。
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厌氧细菌将3 种纤维素酶以特定方式联合组装成一个大复合体— 纤维小体(cenulosome)[10]，具有多种功能的超分子结构。纤维小体附着在细菌细胞表面，所以细菌需要粘附在纤维上，使纤维小体在纤维的接触点处对纤维素进行水解，如热纤梭菌（Clostridium thermocellum）。研究表明，细菌在降解纤维素过程中产生纤维素酶的量较少，且大多不能分泌到细菌细胞外，其大多数对结晶纤维素没有活性，在降解纤维素能力方面，细菌明显低于真菌，因此，很少将细菌投入到工业生产中[11]。
1.3国内外研究概况
在关于纤维素酶活性及发酵时间、温度对产酶的影响研究方面，江龙法等[12]从白酒糟采集的样品中初筛得到产纤维素酶酶活较高的5株菌。纤维素酶和滤纸酶活研究结果表明，这5 株菌在分泌纤维素酶活力及降解滤纸能力方面均较强，其分解纤维素的酶活最高达到11.9 U/ mL，而分解滤纸的酶活力则最高达到64 U/ mL。最适产酶条件为：发酵时间72~ 96 h，发酵温度25~ 30°C。对酒糟发酵减重最高达18%。
李日强等[12]通过对发酵处理后的玉米秸秆和白酒糟的分析，玉米秸秆经发酵处理后粗蛋白、真蛋白和主要氨基酸总量分别比发酵处理前高了576.4 %，31.2 %和501.9 %；白酒糟经发酵处理后粗蛋白、真蛋白和主要氨基酸总量分别比发酵处理前高了65.3 %，64.0 %和50.9 %，而且都具有较高的半纤维素酶和纤维素酶活性，可对秸秆和白酒糟进行持续降解，进一步提高了消化率。
秦广利等[13]在酒糟中提取酒的研究也有了新发现，结果表明，在残糟中添加纤维素酶10 U/g，于58°C的水浴锅中保持5 h，可以提高还原糖的含量，残糟发酵酒精度达到4.67 %vol，出酒率达到31.39 %，出酒率比原糟提高了2.61 %，蒸馏出的产品达到蒸馏白酒各项卫生指标，达到优质酱香白酒的要求，提高了酱香型白酒酒糟的利用价值。
在纤维素利用的研究中，研究的对象多偏重于厌氧高温纤维素分解菌，好氧高温纤维素分解菌涉及较少；研究内容多偏重于分类学方面以及菌株在厌氧发酵纤维素类物质方面的应用。酒糟的利用研究也有进展，归纳起来，主要是通过生物法，将酒糟发酵为动物饲料，或从中再提取酒精，再有就是发酵为有机肥这几大个方面，并从其中衍生出其他的发展方向。
2材料与方法
2.1供试样地区域概况
样品来源地茅台镇位于仁怀市赤水河畔，是茅台酒、文台酒的故乡。平均海拔高度880 m，年平均气温16.3°C，年日照时数1400 h，无霜期311 d，年降雨量800—1000 mL。茅台镇地处河谷，风速小，冬暖、夏热、少雨、少风的特殊小气候十分有利于酿造茅台酒微生物的栖息和繁殖。茅台镇被数目庞大的特殊微生物群笼罩其中，正是它们充当了酿酒业的主力军。
采集的样品放入塑料袋中，封口，置于冰箱中4°C条件下保存。
2.2样品基本理化性质
表2.1为茅台酒厂提供的酒糟、301车间酒糟、酒曲、酒醅、茅台有机高粱基地土壤、废旧稻草等样品的基本理化性质。因为微生物试验的主要对象是微生物，其中空格部分的理化性质是无需检测的指标，理化性质只是作为最后结果的一个比较参考。
表2.1 样品基本理化性质
样品名称
含水率
有机C
有机质
pH
全K
速效K
全P
全N
碱解N
%
g/kg
g/kg
mg/kg
mg/kg
%
g/kg
mg/km
茅台酒糟
0.13
458.22
789.97
3.82
6.55

1.03
27.53

301车间酒糟
0.09
458.55
790.54
4.05
11.44

0.9
34.63

茅台大曲
0.11
474.54
818.11
5.95
5.49

0.86
21.96

茅台酒醅
0.13
450.71
777.03
3.78
5.8

1
31.07

茅台有机高粱基地土壤
0.04
21.99
37.91
7.91

188.55
0.66
2.09
147.01
废旧稻草
0.12
478.82
825.49

15.2

0.49
10.86

小麦粉
0.16
480.58
828.52
6.26
2.47

0.87
25.76

里村组土壤
0.09
12.38
21.35
4.78

151.85
0.41
1.27
129.15
里列组土壤
0.09
10.76
18.54
6.63

107.28
0.32
0.87
68.37
2.3研究内容和技术路线
2.3.1主要研究内容
1．试验在30°C及50°C培养条件下，从茅台酒丢糟、301车间丢糟、酒曲、酒醅、茅台有机高粱基地土壤、废旧稻草样品中分离细菌；
2．对分离得到的菌株分别于30°C和50°C下，采用羧甲基纤维素钠盐培养基培养基进行初筛；
3．对初筛得到的菌株进行生长曲线的测绘，以及滤纸酶活力（FPA）、羧甲基纤维素钠酶活力（CMC）的测定，筛选出纤维素酶酶活性最高的菌株保存。进行一定的不同碳氮源、温度、pH条件下的初略比较，为下阶段研究做准备；
2.3.2技术路线图
酒糟、酒曲、酒醅、废旧稻草、土壤样品的采集制备保存
样品
30℃下细菌分离培养

50℃下细菌分离培养

相关准备工作
30℃、50℃下预备试验
从样品中分离、纯化细菌
通过透明圈大小、滤纸溃烂度初筛出具有分解纤维素的细菌菌株
对筛选出的菌株进行生长曲线测定
进行滤纸、羧甲基纤维素钠酶活测定

鉴定命名保存筛选出的目标菌落

2.4培养基
1．牛肉膏蛋白胨琼脂培养基[14]：牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、琼脂16.0~ 20.0 g、NaCl 5.0 g、蒸馏水1000.0 mL，调pH 7.2-7.4。
2．羧甲基纤维素钠鉴定培养基（CMC-Na）[14]：羧甲基纤维素钠3.0 g、蛋白胨0.2 g 、K2HPO4·3H2O 1.3 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaNO3 2.0 g、KCl 0.5 g、琼脂16.0 g、蒸馏水1000.0mL，调pH 7.2-7.4。
3．LB培养基[14]：蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、酵母膏10.0 g、蒸馏水1000.0 ml、调pH 7.2-7.4。
4．斜面保存培养基：牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、蒸馏水1000.0 mL，调pH 7.2-7.4。
5． 滤纸崩解培养基：蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g、NaCl 5.0 g、蒸馏水1000.0 mL、调pH 7.4，每10.0 mL培养基加入10.0 mL试管中，再加入滤纸（1cm×6cm）。
6．纤维素分解细菌活化培养液：羧甲基纤维素钠10.0 g、蛋白胨5.0 g、酵母膏0.5 g、K2HPO4·3H2O 2.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaCl 5.0 g、蒸馏水1000.0 mL、调pH 7.2-7.4。
7．纤维素分解细菌产酶发酵培养液：羧甲基纤维素钠10.0g、MgSO4·7H2O 0.2 g、CaCl2 0.02 g、K2HPO4·3H2O 1.3 g、KH2PO4 1.0 g、NH4NO3 1.0 g、FeCl3·6H2O 0.05 g、蒸馏水1000.0 mL、调pH 7.2-7.4。
以上培养基于121°C下，灭菌30 min后使用。
2.5主要试剂和仪器
2.5.1试剂
1．DNS 试剂
甲液：溶解6. 9 g结晶酚于15. 2 mL、10 % NaOH 溶液中， 并用水稀释至69 mL， 在此溶液中加6. 9 g NaHSO3.
乙液： 称取255 g 酒石酸钾钠加到300.0 mL、1 0 % NaOH 溶液中， 再加入880.0 mL、1 % 3，5-二硝基水杨酸溶液.将甲、乙二液相混合即得黄色试剂， 贮存于综色冰箱低温保藏1周后使用。

2．柠檬酸缓冲液：称取4. 2 g 柠檬酸溶于200 .0 mL 蒸馏水，配成0. 1 mol / L 柠檬酸溶液，称取5. 88 g 柠檬酸三钠溶于200.0 mL蒸馏水，配成0. 1 mol/ L柠檬酸三钠溶液。量取0. 1 mol / L 柠檬溶液89. 5 mL，0. 1 mol/ L柠檬酸三钠溶液110. 5 mL，混匀，即得pH 4. 85、0. 1 mo l/ L的柠檬酸缓冲液。量取0. 1 mo l/ L柠檬酸溶液57 mL，0. 1 mol / L 柠檬酸三钠溶液43.0 mL，再量取100.0 mL蒸馏水 混匀，配成pH4. 4、0. 05 mol / L 的柠檬酸缓冲液。
3．醋酸缓冲液(pH 5.2)：取10.52 g冰醋酸钠溶于450.0 mL蒸馏水中，用冰醋酸将该溶液的pH值调至5.2（约用l2 mL），用蒸馏水定容至500.0 mL。
4．CMC-Na溶液：称取10.0 g CMC-Na（羧甲基纤维素钠）溶于1000.0 mL醋酸缓冲液（pH 5.2），加热使之溶解，保存于冰箱中，以待使用。
5．葡萄糖标准溶液的配制：将葡萄糖放在110 °C烘箱中烘2 h至恒重，称取0.1080 g烘好的葡糖糖，溶解并定容至100.0 mL。
6．滤纸纸1 %醋酸浸泡24 h，用碘液检验确定无淀粉后。再用2 % NaHCO3洗至中性，晒干待用。
7．革兰氏碘液：碘1.0 g、 碘化钾2.0 g、蒸馏水300.0 mL，将碘与碘化钾先行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300.0 mL。
2.5.2主要仪器

仪器名称
型号
生产厂商
冰箱
BCD-215KALM
青岛海尔股份有限公司
电热恒温培养箱
DH6000BH
天津市泰斯特仪器有限公司
电子天平
ALB-224
赛多利斯科学仪器有限公司
单人单面净化工作台
SW—CJ—1FD
苏州净化设备有限公司
恒温振荡器
ZD—85A
常州澳华仪器有限公司
型电热鼓风干燥箱
101—2AB
天津市泰斯特仪器有限公司
型电热恒温鼓风干燥箱
DHG—9240
上海一恒科技有限公司
紫外可见分光光度计
721GG
上海仪电分析仪器有限公司
高速台式离心机
TGL—16B
上海安亭科学仪器厂

2.6方法
2.6.1分离、纯化
将从贵州茅台酒厂取样到的样品捣碎后，取适量滤液接取10.0 g样品于90.0 mL无菌水中制备成1%的菌悬液，震荡培养30 min用无菌蒸馏水稀释10-2、10-3、10-4、10-5四个梯度，然后再用无菌吸管吸取100 μL菌悬液滴入牛肉膏蛋白胨培养基上涂布均匀，分别在30 °C及50°C恒温培养箱中倒置培养2 d，不同处理均作3个重复。
观察培养皿上菌落形成情况，选取优势菌株和透明圈明显的菌株，CMC-Na培养基上用两区划线培养进行分离和纯化。观察牛肉膏蛋白胨各培养基中的菌落形态特征，拍照并作好详细记录。
2.6.2细菌初筛
将纯化的菌株接种到纤维素钠(CMC-Na)为唯一碳源的固体培养基的上，每个培养基点2 个样，不同处理均作3个重复。
分别于30°C、50°C下倒置培养2 d，每天检测观察各菌株的菌落状况，最后通过滴加革兰氏碘液，静置10 min，倾去染液，将平板置于白色背景下，观察透明圈产生的清晰度，测量菌落及浅色透明圈半径（R，mm），并拍照记录。根据透明水解圈半径和菌落半径的比值大小初步判断菌株产纤维素酶的能力，选取比值大的菌株继续进行研究。
最后保存菌落半径与透明圈比值大于2：4的菌株于牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养基上，其活性与透明圈半径/菌落半径（R/r）在冰箱中4°C条件下保存，以作下一步的研究[15]。
2.6.3细菌生长曲线的测定
从斜面保存培养基挑取菌株单菌落，置于盛有10.0 mL LB 液体培养基的试管中，振荡培养12 h，然后取100 μL 菌悬液置入另外盛有10 mL LB 液体培养液的试管中振荡培养。每4 h取样一次通过分光光度法测定菌体浓度。以未接种的LB培养液做空白对照，依次测定。
用721G可见分光光度计，在660 nm波长处测定吸光度。然后以时间为横坐标，以OD值为纵坐标，绘制菌体生长曲线。
2.6.4纤维素分解细菌的复筛
1．葡萄糖标准曲线的绘制
取7支10 mL试管，编号，按表2.2用移液管准确吸取标准葡萄糖（500 mg/L）溶液与蒸馏水混匀，既得各种不同浓度的标准葡萄糖液。
另取试管7支，编号，用移液管准确吸取上述试管个浓度的标准葡萄糖溶液2.5 mL，对好加入各试管，然后于各试管中加入DNS试剂2.5 mL，摇匀，置于沸水中煮沸5 min。取出后置于冷水浴中冷却，在721G型分光光度计上比色。选用520 nm波长。
表2.2 标准葡萄糖液的制备
管号
制备标准葡萄糖液的浓度（μg/mL）
加500ug/ml标准葡萄液（mL）
加蒸馏水量（mL）
0
0
0
10
1
40
0.8
9.2
2
80
1.6
8.4
3
120
2.4
7.6
4
160
3.2
6.8
5
200
4
6
6
240
4.8
5.2
加入葡萄糖标准液和蒸馏水，在试管中分别加入2.0 mL DNS试剂，于沸水浴中加热5 min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0 mL，摇匀，用721G可见分光光度计，在520 nm波长处测定吸光度。以1.0 mL蒸馏水代替葡萄糖标准液按同样显色操作为空白调零点。以葡萄糖质量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。根据DNS (3，5-二硝基水杨酸)比色法测定原理绘制葡萄糖标准曲线[16]。
2．粗酶液制备
将初筛选取的菌株环取一环接种到纤维素羧甲基钠活化培养液中，30°C通过静置培养、50°C则在120 r /min下振荡培养24 h，不同处理做3个重复。
每24 h 取一次菌液，3500 r/min 下离心5 min，收集上清液用于测定酶活。CMC酶活力的测定：取CMC 缓冲液2.0 mL于比色皿中，加入0.5 mL 稀释10 倍的酶液，50°C 恒温水浴中反应30 min，加入3.0 mL DNS 试剂，沸水浴10 min，冷却后定容至25.0 mL。在520 nm 处测OD 值，测得OD 值后查阅葡萄糖标准曲线，求出酶解所得葡萄糖含量，换算成酶活力值。
3．滤纸崩解的测定
分别用接种环取一环初筛得到的菌种，将其接种到装有10 mL滤纸培养液的10mL试管中，置于30°C、50°C恒温摇床，120 r /min下振荡培养，每天检查记录各菌株对滤纸的作用情况[17]。
观察其酶活力的分解强度，以+、—标示作用情况，本方法是以肉眼观察为主，主观意识为主，结果的表示只能为试验提供参考，不能作评判的依据，但用于筛选目标菌株有很大的适用性，再配以其他方法，不是为有效的手段。具体表示：+滤纸边缘膨胀；+ + 滤纸整齐膨胀并下弯； + + + 滤纸不定形；+ + + + 全成糊状。若滤纸不到2 4 h 全部分解，则记下达到全部被分解的时间，拍照记录。
4．CMC酶活力测定
酶液的稀释：取大号试管13只，用移液管吸取离心后的酶1 mL，加水24 mL，摇匀。还原糖的测定：取刻度试管26只，个加入稀释酶液0.5 mL，CMC缓冲液（柠檬酸缓冲液）2.0 mL。每次测酶活时均设一个总的空白样，即在试管中不加底物和酶液，只加蒸馏水1.0 mL，用作测量吸光度时的参比。对每个样品都设一个参照样，先加0.6 mL蒸馏水，后加0.5 mL相应样品的粗酶液。
在容积为10 mL的试管管中，加入1 mL 适当稀释的酶液于50°C和30°C 恒温水浴中预热5 min后，摇匀，将试管置于水浴锅中，50°C恒温水浴加热，充分反应30 min。将试管从水浴锅取出后，往所有试管中加入0.5 mL DNS试剂，然后又放入水浴锅，沸水浴5 min。迅速冷却试管，并加蒸馏水定容至10.0 mL。在560 nm 波长处测吸光度并做好记录。定义每分钟催化纤维素水解生成1 μg葡萄糖的酶量为一个酶活单位，即在50°C下，每1 g纤维素酶曲在1 min内水解CMC，生成1 ug葡萄糖的酶活性称作纤维素酶活力单位，记作U。
葡萄糖量
=
[(mg/mL)•30 min]
1/10
式中 葡萄糖量：从标准曲线上查的（mg）；
1/10： 稀释倍数；
30： 糖化时间（min）。
3结果与分析
3.1分离、纯化结果
利用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，分10-2、10-3、10-4、10-5四个不同稀释梯度，2至3组平行，从茅台酒丢糟、301车间丢糟、酒曲、酒醅、茅台有机高粱基地土壤、废旧稻草样品中初步分离到近千个菌株，在观察菌落生长状况、菌落形态特征的同时，如表3.1整理统计了不同稀释梯度下的菌落生长情况。细菌的纯化一般采用二区划线法，通过这种方式，进一步分离所筛选的菌种。
表3.1 菌落计数统计
菌株编号
稀释10-2（计数） 稀释10-3（计数） 稀释 10-4（计数） 稀释10-5（计数）
茅台酒糟B1
200-328
24-42
4-8
-
301车间酒糟B2
400以上
105-142
34-54
7-13
茅台大曲B3
700以上
74-108
32-38
4-14
茅台酒醅B4
124-165
17-22
4-11
-
茅台有机高粱基地土壤B5
500以上
201-274
34-56
8-17
废旧稻草B6
连片
连片
289-321
32-57
根据菌落数30-300为最佳，从表3.1可以看出，B1的最佳稀释度为10-2、10-3，B2的最佳稀释度为10-3、10-4，B3的最佳稀释度为10-3、10-4，B4的最佳稀释度为10-2、10-3，B5的最佳稀释度为10-3、10-4，B6的最佳稀释度为10-5。
3.2菌株初筛结果
3.2.1初筛情况统计
通过对近千个菌株的初筛，用羧甲基纤维素钠鉴定培养基进行培养，滴加革兰氏碘液有透明圈的244株。其中，菌落半径最大的为2.0 cm，BL5-95透明圈与菌落半径比值最大的，达到15。透明圈与菌落半径比值超过10的有12株，透明圈与菌落半径比值超过5的有103株。
50°C培养条件下的，选取透明圈半径超过2 cm，透明圈与菌落半径比值大于3的7株菌；30°C培养条件下的，选取透明圈半径超过1.5 cm，透明圈与菌落半径比值大于5的6株菌。
共选取13株菌进行纤维素酶活力等测定，图3.1是初筛时几株透明圈较为明显细菌。

图3.1 几株细菌CMC培养基透明圈情况
将透明圈与菌落半径比值较突出的13株菌，根据初筛过程顺序分别编号为BH1-9、BH3-14、BH3-31、BH5-20、BH5-26、BH5-36、BH6-34、BL3-45、BL4-65、BL5-58-1、BL5-95、BL5-99、BL5-106。 其中BL5-58-1是在纯化BL5-58时被发现的，后来发现透明圈半径比: BL5-58更大，就一直以此命名。表3.2是个菌株透明圈与菌落半径比值及其他数据统计情况。
表3.2 初筛中13株细菌透明圈与菌落半径比值
样品编号
菌落半径（cm）
透明圈半径（cm）
透明圈与菌落半径比值
培养温度
培养时间
BH1-9
0.60
2.00
3.33
50°C
3d
BH3-14
0.55
2.20
4.00
50°C
3d
BH3-31
0.50
2.10
4.20
50°C
3d
BH5-20
1.00
2.30
2.30
50°C
3d
BH5-26
0.50
2.00
4.00
50°C
3d
BH5-36
0.60
2.10
3.50
50°C
3d
BH6-34
0.70
2.40
3.43
50°C
3d
BL3-45
0.20
1.50
7.50
30°C
3d
BL4-65
0.25
1.50
6.00
30°C
3d
BL5-58-1
0.30
1.60
5.33
30°C
3d
BL5-95
0.10
1.50
15.00
30°C
3d
BL5-99
0.15
1.50
10.00
30°C
3d
BL5-106
0.30
1.70
5.67
30°C
3d
3.2.2初筛的保存
初筛的保存如图3.2，以牛肉膏蛋白胨作为保存培养基。保存在4°C条件下，待到用时再取出，但要注意保存时间不宜过长，通常为7 d。做长期保存则是将菌种接种到斜边保存基上，4°C低温保存。

图3.2 短期平板保存培养基
3.3细菌生长曲线测定结果
测定生长曲线所用到的波段没有固定的要求，经过具体的测定发现，在波长较小的情况下（440nm）所测定的值会大于较高的值（660nm），这要求根据菌悬液的浊度调整相对较佳的值，当菌悬液浊度教小时用低波段测定，反之用高波段测定，最好将最后测定的最大值控制在1.000之内。
在测定细菌生长曲线时，通过观察发现。30°C静置培养下的菌悬液，其沉淀量少、液面无菌苔或菌苔量微小、液体中颗粒物分布均匀、液体昏暗浑浊、细菌生长规律；而50°C、120 r /min振荡培养下的菌悬液，沉淀量大、液体中分布有絮状物、液面有菌苔生长、液体中颗粒物分布不均匀、液体颜色呈清透亮、细菌生长情况很难判明。
通过肉眼的观察判断，50°C、120 r /min振荡培养下的菌种，其吸光度因颗粒分布不均，必然无法准确测定。最后通过721G可见分光光度计的测定证实以上推断。
表3.3中记录的数值，50°C、120 r /min振荡培养下的菌悬液吸光度只能略作结果的参考。
表3.3 LB菌悬液OD测定
菌株编号
0（h）OD660nm
4（h）OD660nm
8（h）OD660nm
12（h）OD660nm
16（h）OD660nm
20（h）OD660nm
24（h）OD660nm
28（h）OD660nm
32（h）OD660nm
36（h）OD660nm
40（h）OD660nm
BH1-9
0.000
0.113
0.146
0.139
0.084
0.710
0.660
0.053
0.228
0.195
0.103
BH3-14
0.000
0.218
0.223
0.243
0.232
0.253
0.267
0.310
0.338
0.102
0.100
BH3-31
0.000
0.088
0.092
0.123
0.142
0.146
0.213
0.189
0.317
0.083
0.031
BH5-20
0.000
0.062
0.074
0.043
0.046
0.054
0.065
0.065
0.075
0.031
0.036
BH5-26
0.000
0.012
0.022
0.020
0.043
0.039
0.021
0.032
0.023
0.035
0.054
BH5-36
0.000
0.033
0.032
0.024
0.032
0.042
0.310
0.026
0.023
0.014
0.048
BH6-34
0.000
0.059
0.096
0.137
0.119
0.134
0.139
0.216
0.207
0.153
0.190
BL3-45
0.000
0.010
0.023
0.037
0.035
0.042
0.087
0.114
0.146
0.071
0.142
BL4-65
0.000
0.041
0.023
0.038
0.034
0.045
0.063
0.087
0.133
0.142
0.081
BL5-58-1
0.000
0.008
0.002
0.005
0.010
0.013
0.008
0.006
0.009
0.001
0.014
BL5-95
0.000
0.007
0.003
0.005
0.011
0.020
0.013
0.016
0.014
0.004
0.010
BL5-99
0.000
0.514
0.544
0.605
0.672
0.792
0.817
0.835
0.649
0.756
0.784
BL5-106
0.000
0.498
0.632
0.645
0.669
0.951