菠萝蛋白酶提取荸荠果胶的研究毕业论文.doc

内江师范学院化学化工学院

毕 业 论 文

论文题目:
菠萝蛋白酶提取荸荠果胶的研究

内江师范学院毕业论文（设计）
目 录

中英文摘要 2
1 前言 3
2 实验材料 3
2.1 材料和试剂 3
2.2 仪器 4
3 实验方法 4
3.1 原料的处理 4
3.2 荸荠果胶的提取 4
3.3 荸荠果胶中总半乳糖醛酸含量的测定 4
4 结果与讨论 5
4.1 单因素对荸荠果胶提取的影响 5
4.1.1 反应时间对提取的影响 5
4.1.2 酶用量对提取的影响 5
4.1.3温度对提取的影响 5
4.1.4 料液比对提取的影响 6
4.1.5 pH值对提取的影响 6
4.2 优化与验证 7
4.3 产品检测 8
5结论 8
参考文献 10
声明 11
致谢 12

菠萝蛋白酶提取荸荠果胶的研究

摘 要：以荸荠皮为原料研究菠萝蛋白酶法提取荸荠果胶的最佳工艺条件。通过荸荠皮果胶提取率为指标，研究提取温度、料液比、酶用量和pH 值对果胶提取率的影响。通过单因素实验和正交实验确定提取工艺，结果表明: 菠萝蛋白酶法提取荸荠皮果胶的最佳工艺为温度55 ℃、料液比1：18、加酶量6mL 和pH 值8,在此条件下荸荠皮中果胶提取率为23.9%。
关键词: 菠萝蛋白酶;荸荠皮;果胶;提取率
Research of Bromelain Extract Water Chestnut pectin

Abstract: The optimal process conditions for the extraction of water chestnut peel water chestnuts pectin materials research bromelin method. Rate as the index by Eleocharis tuberose peel pectin extraction, extraction temperature, ratio of material to liquid, enzyme dosage and effect of pH value on the pectin extraction rate. Through single factor experiment and orthogonal experiment to determine the extraction process, the result shows that: the optimum extraction technology of pectin from Eleocharis tuberose peel bromelin method for temperature 55 ℃, solid-liquid ratio was 1:18, the amount of enzyme 6mL and pH value of 8, under the condition of water chestnut peel pectin extraction rate was 23.9%.
Key words: Bromelain; Eleocharis tuberose peel; pectin; extrctiontion rate

菠萝蛋白酶提取荸荠果胶的研究

1 前言
果胶是一种广泛存在于高等植物细胞壁中无毒、无刺激性，颜色为白色至黄褐色粉末
的多糖类植物胶,并在水果和蔬菜中多以不溶于水的原果胶存在, 可在适度酸的作用下,
形成可溶性果胶并稳定存在, 但在强酸强碱下都易解聚[1]。果胶在我们日常生活中应用很
广泛，主要具有以下四点用途：（1）在食品工业上，果胶主要利用其凝胶性生产胶冻、果
酱和软糖。（2）在医药方面可用作止血剂和代血浆，也可用来治疗腹泻和重金属中毒等。
（3） 用作乳化稳定剂和增稠剂以及黏结剂，我国规定可用于各类食品，按使用需求适量
生产。（4）多用于化妆水、酸性牙粉等,由于它在碱性介质中不够稳定,因此不能用于碱性
化妆品。
荸荠原产印度，中国主要分布于广西、江苏和安徽等低洼地区,荸荠球茎约含碳水化合物21%，蛋白质1.5%。荸荠在我们日常生活中一般具有以下五点用途：（1）可生食或熟食，也能用于加工罐藏以及用作提取淀粉的原料。（2）在医药方面有止渴、消食、解热功能。（3）由于荸荠中含的磷是根茎类蔬菜中较高的，所以能促进人体生长发育和维持生理功能的需要。（4）荸荠果皮中含有较丰富的果胶，虽然果胶是不能提供能量的，但对人体正常的生理代谢起着重要作用。（5）多吃荸荠的人牙齿骨骼发育一般都很好，同时荸荠也可以促进人体内的糖、脂肪、蛋白质三大物质代谢的转化和调节人体内酸碱度平衡，因此儿童也可以大量食用荸荠。而据不完全统计，我国每年约消耗1500多吨果胶，其中80%均为国外进口；因此对果胶生产工业进行研究生产出优质果胶，满足市场需求尤为重要[2]。目前果胶的提取方法有以下几种：酶提取乙醇沉淀法、离子交换法、酸提取盐沉法以及微生物法、离子交换法、膜分离技术、微波提取法、化学铁盐法，但酶法和膜分离法成本较高[3]。超声波用于天然产物的辅助提取[4]。而提取果胶最成熟的方法是酶法，目前报道从荸荠中提取果胶方法却只有酸法。本实验研究菠萝蛋白酶法对荸荠果胶进行提取，考察反应时间、酶用量、温度、料液比、pH值对果胶提取的影响 。
2 实验材料
2.1 材料和试剂
新鲜荸荠皮（购于四川内江市临江小区菜市场）；YY10508-25g菠萝蛋白酶（上海源叶生物科技有限公司）、无水乙醇（99.7%）、一水合柠檬酸（成都金山化学试剂有限公司）、柠檬酸三钠（成都市新都区木兰镇工业开发区）、盐酸（0.5mol/L）、氢氧化钠（0.1mol/L）、活性炭、标准邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液。
缓冲溶液的配制：称取21.014g柠檬酸配成1000mL溶液，称取29.014g柠檬酸三钠配成1000mL溶液，按比例混合（柠檬酸三钠溶液与柠檬酸溶液混合）调节pH后，用pH计精确调节pH值。
菠萝蛋白酶溶液的配制：精确称取0.02g活力值≥500U/mg的菠萝蛋白酶，配成100mL溶液，现配现用。
2.2 仪器
DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（郑州长城科技工贸有限公司）；TD5-1台式低速离心机（四川蜀科仪器有限公司）；pHS-3E精密pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；BT-323S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；SHZ-C型循环水式多用真空泵（巩义市英峪仪器厂）；600克摇摆式高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；HH-S2数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）。
3 实验方法
3.1 原料的处理
洗净新鲜的荸荠皮，将荸荠皮在沸水中煮5min左右，并用煮沸过的沸水冲洗数次以除去部分可溶性的糖，沥干水分，在55～60℃下烘24小时。用粉碎机粉碎3～5min，并用100目筛进行过筛。将制好的荸荠皮粉密封存放在干燥器中备用。
3.2 荸荠果胶的提取
准确称取3g已制备好的荸荠皮粉于250mL烧杯中，加入一定体积已调节好pH值的缓冲（柠檬酸/林檬酸三钠）溶液，再向烧杯中加入一定体积浓度为0.02%g/L、活力值≥500U/mg的菠萝蛋白酶溶液，用保鲜膜盖住烧杯并将烧杯置于水浴锅中（控制一定温度）不断搅拌，反应一定时间后，立即将烧杯内的溶液一并转移到95℃的数显恒温水浴锅中灭酶5min，趁热离心取上层清液，将滤渣用煮沸的水冲洗2～3次并合并滤液（若滤液有颜色可加少量活性炭进行吸附再过滤，滤液不纯将其过滤为清液）。向滤液中加入99.7%的无水乙醇溶液（加入乙醇的量为滤液体积一倍多为好）并不断搅拌，过一会就明显可以观察到加入无水乙醇后析出白色絮状物，放置1小时后用布氏漏斗过滤，用75%的乙醇溶液洗涤沉淀2～3次，产品置于45～50℃的干燥箱中干燥、称重、计算提取率，平行实验3～5次。
3.3 荸荠果胶中总半乳糖醛酸含量的测定
参考GB 25533-2010《食品添加剂果胶》中方法进行荸荠果胶中总半乳糖醛酸含量的测定[18]。
荸荠果胶提取率：粗提率=（粗果胶质量/荸荠皮粉的质量）*100%
荸荠果胶的纯度计算：总半乳糖醛酸百分含量 X（%）=（V1+V2）*19.41*100%/m2
4 结果与讨论
4.1 单因素对荸荠果胶提取的影响
4.1.1 反应时间对提取的影响
控制提取温度为55℃，缓冲溶液的pH为6，料液比为1:22，用0.02%g/L的菠萝蛋白酶6mL；分别控制提取时间为1h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h，测定荸荠果胶的提取率。结果表明（如图1所示）：随着反应时间的增长, 果胶的提取率逐渐增高, 在提取时间为 1.5h 时最好, 但继续随着提取时间的延长, 果胶提取率反而降低，并且在 2.0h～2.5h 时果胶提取率趋于平缓，这可能是提取出的果胶随着提取时间增长被分解了, 从提取效率上来讲：大量浪费时间却产量不佳，所以说明浸提时间以 1.5h 为最佳, 浸提时间过长或过短都会影响荸荠果胶提取率。

图1 反应时间对提取的影响 图2 加酶量对提取的影响 Fig. 1 Effect of reaction time on Extraction Fig. 2 Effect of enzyme concentration on the extraction

4.1.2 酶用量对提取的影响
控制提取温度为55℃，缓冲溶液的pH为6，料液比为1:22，提取时间为1.5h，分别用0.02%g/L的菠萝蛋白酶为2mL、4mL、6mL、8mL、10mL反应，测定荸荠果胶的提取率。结果表明（如图2所示）：当加入酶量低于 6mL 时, 果胶提取率随加入菠萝蛋白酶用量的增加而逐渐上升；当加酶量超过 6mL 时, 随加入菠萝蛋白酶的量越多果胶提取率反而降低。故加酶量以6mL为佳。
4.1.3 温度对提取的影响
控制提取时间为1.5h，缓冲溶液的pH为6，料液比为1:22，用0.02%g/L的菠萝蛋白酶6mL；分别控制提取温度为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃，测定荸荠果胶的提取率。结果表明（如图3所示）：当温度低于 55℃ 时, 果胶提取率随浸提温度的升高而逐渐增高； 当温度超过 55℃ 时, 随浸提温度的升高果胶提取率反而逐渐降低。这可能是由于菠萝蛋白酶有其反应的最适温度。温度过低, 达不到最大活性, 温度过高导致菠萝蛋白酶酶变性失活, 使果胶提取率下降, 影响果胶产量[1], 故浸提温度以 55℃ 为佳，浸提温度过高或过低都会影响荸荠果胶提取率。

图3 温度对提取的影响 图4 料液比对提取的影响
Fig. 3 Effect of temperature on Extraction Fig. 4 Effect of ratio of material to liquid on Extraction

4.1.4 料液比对提取的影响
控制提取温度为55℃，缓冲溶液的pH为6，提取时间为1.5h，用0.02%g/L的菠萝蛋白酶体积为6mL，分别控制料液比为1:12、1:18、1:22、1:25、1:30，测定荸荠果胶的提取率。结果表明（如图4所示）：在料液比不同的条件下, 果胶的提取率也不相同。料液比由 1:12 增加到 1:22 时, 果胶的提取率升高较慢；继续再增加料液比，提取率升高幅度较大，直到料液比大于 1:25 时,果胶的提取率随料液比的增加而降低。故料液比为 1:25 时最佳。
4.1.5 pH值对提取的影响
控制提取温度为55℃，提取时间为1.5h，料液比为1:25，用6mL浓度为0.02%g/L的菠萝蛋白酶，分别用pH为3、4、5、6、7、8的缓冲溶液调节pH，测定不同酸度下荸荠果胶的提取率。结果表明（如图5所示）：在不同的pH值条件下, 果胶的提取率也不相同。在pH值小于 6 时, 果胶的提取率随pH值的升高而逐渐升高； 在pH值大于 6 时, 果胶的提取率随pH值的升高反而降低。所以菠萝蛋白酶液酸度pH值为 6 较为合适。

图5 pH值对提取的影响
Fig. 5 Effect of pH value on Extraction
4.2 优化与验证
根据单因素实验的结果，分别对提取温度、提取所需的酶体积量、pH值、提取所需的料液比等因素对果胶提取率最大的3个组进行Lg(34)正交试验来优化提取荸荠皮中果胶的最佳工艺参数。并对正交实验进行设计和实验结果分析（如下表所示）。

表1 正交实验设计
水平
温度（℃）/A
料液比/B
酶用量（mL）/C
pH值/D

1
50
1:18
4
6
2
55
1:22
6
7
3
60
1:25
8
8

表2 正交实验结果
水平
温度（℃）/A
料液比/B
酶用量（ml）/C
pH值/D

产量/（g）
提取率/（%）
1
50
1:18
4
6
0.669
22.3
2
55
1:22
6
7
0.624
20.8
3
60
1:25
8
8
0.530
17.7
4
50
1:25
4
7
0.606
20.2
5
55
1:18
6
8
0.671
22.4
6
60
1:22
8
6
0.677
22.6
7
50
1:22
4
8
0.559
18.6
8
55
1:25
6
6
0.686
22.7
9
60
1:18
8
7
0.547
17.2
K1
20.267
20.967
20.400
19.733

K2
21.767
20.667
22.633
19.567

K3
19.833
20.200
19.500
22.533

R
1.934
3.133
0.767
2.966

优水平
A2
B1
C2
D3
0.707
23.9
主次顺序
C>D>A>B
优组合
A2B1C2D3

方差分析结果表明，第8组果胶提取率最高。结合极差分析可知B因素（料液比）的极差最大，D因素（pH值）的极差次之，因此料液比和pH值为试验果胶提取率的重要因素，适当增加浸提液的料液比和pH值，对荸荠皮果胶提取率影响较大。从节约能源和减少污染的角度综合考虑，A2B1C2D3为试验条件的最佳组合，即在浸提温度在55℃、浸提料液比为1:18、0.02%的菠萝蛋白酶用量为6mL、浸提pH为8的条件下可得到果胶的最大产量（即A2B1C2D3条件下提取工艺最佳）。在此优化的工艺条件下，其果胶的提取率达23.9% 。
4.3 产品检测
经测定总半乳糖醛酸百分含量 X（%）=52.02%，不符合国家 GB 25533-2010《食品添加剂 果胶》中纯度（≥65%）和美国药典 USP 32-NF27 中果胶纯度（≥74%）要求，纯度有待进一步提高。
5 结论
荸荠皮中含有比较丰富的果胶，利用荸荠皮提取果胶，既解决了荸荠带来的环境污染问题，又为食品、医药品以及化妆品工业增加了新的果胶物质来源。本实验通过单因素试验和正交试验分析得到菠萝蛋白酶提取荸荠皮果胶的最佳组合为：浸提温度在55℃、浸提料液比为1:18、0.02%的菠萝蛋白酶用量为6mL、浸提pH为8，果胶提取率可达到23.9%，明显高于正交试验中的各组试验结果，纯度达52.02%。该方法的提取纯度有待提高，望广大读者在此基础上继续研究。

参考文献
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声　　明
本人声明所呈交的毕业论文是本人在导师指导下进行的研究成果。除文中特别加以标注和致谢的地方，论文不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得内江师范学院或者其他教育机构的学位或毕业证书而使用过的材料。
本毕业论文成果是本人在内江师范学院读书期间在导师的指导下取得的，论文成果归内江师范学院所有，特此声明。

学生：
2012年5月18日

致 谢
值此论文完成之际，衷心感谢我的指导教师王碧老师的悉心指导和热情帮助。王碧老师在我的毕业论文的整个过程给予了极大的指导，从论文的选题、文献的采集、实验的设计、实验的指导、结构的布局到最终的论文定稿，从内容到格式，从标题到标点，他都费尽心血。没有王碧老师的辛勤劳作、不厌其烦，就没有我论文的顺利完成，在此表示衷心的感谢。同时，感谢内江师范学院化学化工学院所有的领导和老师们在我的大学生涯里悉心的指导和帮助，正是他们无私的奉献才教会了我如何学习，如何做人，如何做事。
也感谢我的家人，同学，朋友对我一如既往的支持使我能够继续去追求自己的人生理想和目标，愿他们身体健康，万事如意！
衷心感谢参加我论文评阅和答辩的各位老师！
最后，感谢培育我的母校！

吉克木呷
2014年5月于内江

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