蛋白质连接关键技术.doc

蛋白质连接技术
主 编
洪孝庄 孙曼霁
编 著 者
洪孝庄 孙曼霁 龚雄麒
仲伯华 沈倍奋 陈泮藻
李春海 卢秀桂 何云汉
中 国 医 药 科 技 出 版 社．
前 言
随着生物医学研究迅速发展，在其相应研究领域中也浮现许多新颖应用技术，蛋白质连接技术即是其一。蛋白质连接技术浮现最早是在本世纪代，在化学免疫研究中，初次合成人工抗原时已开始使用。此后，在免疫学研究中，特别是在免疫标记技术中广为应用并迅速发展。从40、50年代免疫荧光技术，60年代放射免疫技术，到70年代酶免疫技术，及在此先后浮现发光免疫技术、胶体金免疫技术和稀土元素免疫标记技术等都大大丰富和发展了蛋白质连接技术。更为突出是在1975年单克隆抗体研制成功，以及化学家们新合成各种异型双功能交联剂浮现，更将蛋白质连接技术应用推向新天地。近些年来，在国内外非常活跃研究领域——导向药物、免疫毒素相载体释放药物研究中，亦广泛采用此类蛋白质连接技术。如将某种药物(例如抗肿瘤药物)或毒素与载体分子(如单克隆抗体或受体)进行交联构成导向药物，人们誉之为“生物导弹”。应用这种技术，将抗肿瘤药物(如多诺霉素、丝裂霉素、氨甲蝶蛉等)或毒素(如白喉毒素、蓖麻毒素、红豆毒素等)作为弹头药物与肿瘤单克隆抗体作导向载体所制成导向药物，对相应肿瘤细胞杀伤力大大超过普通抗肿瘤药物。毒素大多都是蛋白质，因此，上述蛋白质连接技术则可选用于导向药物制备。更为可喜是，近些年来，在分子生物学研究中，特别是在核酸探针研究与应用中，蛋白质连接技术也大显身手，有人称其为分子生物学支撑技术。随着这一技术应用及其在有关研究领域不断开拓，蛋白质交联办法也不断改进和渐趋完善，使其在生物医学领域中得到广泛应用和注重。
当前，蛋白质连接技术不但广泛应用于人工抗原合成，并且在小分子物质(如毒物、药物、激素等)和生物大分子标记免疫分析(放射免疫分析RIA、酶免疫分析EIA、荧光免疫分析FIA、发光免疫分析CIA、时间辨别免疫分析TrFIA)、标记受体分析(放射受体分析RRA、酶受体分析ERA)及竞争蛋白结合分析等配体结合分析办法中，普遍用作标记配体制备办法。此外，在基因探针标记、肿瘤标志和诊断研究中也广为采用。
蛋白质连接技术是一种具备理论研究和实际应用价值新技术，近几年来迅速发展和更趋成熟。但是，在实际应用中，它所涉及问题较多，无论从理论上或在实践中都还存在某些需要进一步阐明和有待解决问题。当前，涉及这一技术国内外文献及著述不少见，也是人们非常数悉。然而，至今未见到对此类技术较为全面系统阐述。
为满足关于科技研究工作需要，咱们几位作者，依照近年科研实践之所得，并参阅关于文献，从简介化学反映重要类型出发，以生物医学研究中实际应用为目编写本书，愿为同行提供有用研究工具。由于本书涉及内容较广，作者水平有限，经验局限性，书中难免有谬误之处，敬请读者批评指正。
洪孝庄
军事医学科学院毒物药物研究所
1992年5月

第一章 蛋白质交联办法及其应用
仲伯华 龚雄麒
(军事医学科学院毒物药物研究所)
蛋白质交联系指将小分子物质（如药物、半抗原等）或大分子物质(如酶、蛋白毒素等)以共价键方式连接于蛋白质分子，以制备人工抗原、酶标抗体、载体释放药物、抗体导向药物和免疫毒素等。随着放射免疫分析法、酶标免疫技术、载体药物学和导向物学发展，蛋白质交联技术办法和手段也不断改进和完善，并且在生物学和医学领域得到愈来愈广泛应用。
蛋白质交联办法一方面发展于人工抗原制备研究。自70年前Landsteiner第一次合成人工抗原以来，人们将许多没有抗原性小分子物质(半抗原)如化学药物、神经递质和激素等与蛋白质或多糖等载体大分子共价结台；使其具备抗原性，以诱发动物产生特异性抗体，用于放射免疫分析等。为了使放射免疫分析达到敏捷度高、特异性强规定，前人对半抗原和蛋白质连接办法进行了大量研究，建立了重氮化法、戊二醛法、混合酸酐法、二异氰酸酯法及卤代硝基苯法等交联技术。
近10近年来发展起来酶标免疫检测技术，规定制备保持酶生物活性和抗体免疫结合活性酶—抗体偶合物。惯用交联办法如戊二醛法、碳二亚胺法和混合酸酐法不可避免地要产生酶或抗体自身交联产物或多聚物，致使交联效率减少、结合物活性削弱。为了克服这一局限性，人们发展了异型双功能交联试剂，如N—羟基琥珀酰亚胺—3—(2吡啶基二硫)—丙酸酯，以实现控制交联，提高交联反映选取性和交联产物均一性。
将药物与大分子载体连接，制备药物一载体结合物，以改进和控制药物在体内转运和代谢，实现缓释给药和定向给药，提高生物运用度和治疗指数。这是当代药物研究领域一种崭新分支。载体药物必要可以在体内定量、定位释放原型药物，因而规定设计pH敏感或特定酶敏感偶联键。
导向药物发展对蛋白质交联办法提出了更高规定。早在19，Ehrlich就提出了靶向给药设想。随着生物医学发展，这一设想不断得到详细实现。单克隆抗体作为导向载体浮现，更使导向药物研究成为当代药物研究中最活跃和最引人注目领域之一，而其中研究得最广泛是肿瘤治疗抗体导向研究。其载体重要有针对肿瘤细胞表面有关抗原抗体及其片断，肿瘤细胞表面受体模仿配基。这些载体与药物或毒素分子连接而成偶合物，可以选取性地杀伤肿瘤细胞，被誉为“生物导弹”。为了最大限度地保持导向载体和药物弹头生物活性，同步实现最大药物载运量，人们不断创新交联剂，改进交联办法，发展了一批新各具特性异型双功能交联剂，提高了导向药物有效性和实用性。
随着新交联试剂和交联办法浮现，使得放射免疫、酶标免疫和导向药物研究不断进一步；而后者发展又反过来增进蛋白交联技术趋于成熟。当前交联办法可以将任一种半抗原或细胞毒分子以一定方式与载体交联，获得所需偶合物。下面分别简介蛋白质交联中惯用试剂、办法及其应用。
一、交联办法
普通说来，蛋白分子中可以用于交联活性基团有游离氨基(如赖氨酸c—氨基或末端氨基)、游离羧基(如天冬氨酸残基，谷氨酸残基及末端羧基)、苯基(苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸)、酚基(酪氨酸)、巯基(半胱氨酸)、羟基(丝氨酸或苏氨酸)、咪唑基(组氨酸)、吲哚基(色氨酸)或胍基(精氨酸)等。
为了避免蛋白质变性及其生物活性损失，药物或半抗原等与蛋白交联应采用品有中档反映活性试剂，在温和条件(如接近中性pH、室温、水溶液中)进行。
(一)重氮化法
含芳香胺化合物，可以与亚硝酸反映形成重氮盐，然后直接连接于蛋白质分子中酪氨酸残基上酚羟基邻位，即得以偶氮键相联结合物。这种重氮盐也能与组氨酸残基上咪唑环或色氨酸残基吲哚环反映：

本办法副反映较多，故普通限于人工抗原制备。
(二)戊二醛法
同型双功能交联剂戊二醛两个醛基可以分别与两个相似或不同分子上伯氨基形成Schiff氏碱，将两分子以五碳链桥连接起来。

戊二醛连接反映是最温和交联反映之一，可在4~40℃温度范畴，pH6.0~8.0缓冲水溶液中进行，但是缓冲组份中不得具有氨基化合物。以硼氢化钠或氰基硼氢化还原Schiff氏碱可以形成稳定单键；依照对偶联键不同规定，还原环节也可省略。但是，本交联办法易形成相似蛋白间连接；产物均二性较差。因而，多用于酶标抗体制备。
(三)过碘酸盐氧化法[1]
糖类或含糖基化合物分子中邻二醇构造可被过碘酸钠氧化为醛基，然后与蛋白分子中氨基形成Schiff氏碱：

与戊二醛交联反映相似，过碘酸钠氧化法比较温和，可在常温和中性pH条件下进行。这是一种两步反映，第一步生成醛基衍生物后，过量过碘酸盐必要除去或消耗后，方可进行与蛋白交联第二步反映。
(四)混合酸酐法
半抗原或药物及其衍生物分子中羧基可以在三级胺存在下与氯甲酸异丁酯反映，生成活泼中间体混合酸酐，然后与蛋白载体上伯氨基反映，形成酰胺交联键：

本反映过程简朴，毋需制备和分离中间产物。
(五)碳二亚胺法
碳二亚胺是一类很强脱水剂，能使羧基和氨基脱水形成酰胺键。在反映时，一种分子中羧基先与碳二亚胺反映生成一种加成中间产物，再与另一分子上氨基反映形成酰胺键，实现两者交联：

除戊二醛外，碳二亚胺是常用另一类交联剂，最早用于药物化学和有机化学领域；脂溶性二环己基碳二亚胺至今仍被广泛用于多肽合成领域，但其反映必要在有机溶剂中进行，不合用于蛋白质交联。水溶性1—乙基—3—(3—二甲基氨基丙基)—碳二亚胺(EDC)等浮现，使这一缩合反映成功地用于蛋白质交联中。本交联反映条件温和虽然在冷却条件下，也能于中性pH中进行。但是，由于碳二亚胺缩合反映没有选取性；易形成蛋白分子间自身聚合，产生非均一性产物；先将含羧基药物或半抗原分子与EDC反映，活化羧基后，再加入蛋白反映物，可以减少蛋白分子交联。

(六)活泼酯法[2]
具有羧基半抗原或药物在二环己基碳二亚胺(DCC)作用下，与N—羟基琥珀酰亚胺反映，生成活泼酯衍生物，后者与载体蛋白上氨基反映，形成以酰胺键连接偶合物：

本法是对碳二亚胺法改进：由于避免了碳二亚胺对蛋白直接作用，从而避免了蛋白分子间交联。活泼酯法在导向药物研究中得到广泛应用。
(七)多元酸酐法[3]
半抗原或药物分子中羟基或氨基与琥珀酸酐、顺—乌头酸酐等在无水吡啶催化下反映，形成单酯或单酰胺衍生物，引入游离羧基，然后以活泼酯法或碳二亚胺法与蛋白交联：

多元酸酐法可以十分以便地将小分子中羟基或氨基转变为合游离羟基衍生物，具备较广应用范畴。但是，与羟基形成酯健在血浆中不稳定；而与氨基形成酰胺键又往往不能充分降解；释放游离药物，影响导向药物效价。有趣是，药物通过顾—乌头酸与蛋白形成偶合物，在中性pH介质(如血浆中)稳定，而在酸性pH介质中充分解离，释放活性药物。由此产生溶酶体内降解性复合物，经细胞内化后，进入溶酶体内，在酸性条件下解离。
(八)二异氰酸酯法
二异氰酸酯类双功能试剂中两个异氰酸基分别与两个不同分子上氨基反映，介以不同碳链长度桥将两者偶联：

此类试剂除了能与氨基反映形成取代脲外，(在pH＞7时为重要反映)，尚能与羟基反映形成氨基甲酸酯衍生物；水溶液中副反映(如第二个异氰酸酯基水解产生胺，能与另一异氰酸酯分子连接)，也许通过疏水作用导致蛋白聚合。
(九)偶氮苯甲酸法
对氨基苯甲酸重氮化后，与带苯环半抗原偶联引入羧基，再运用羧基反映连接于蛋白上：

(十)O—羧甲基羟胺法
半抗原上酮基与O—羧甲基羟胺反映，制备羧甲基肟衍生物。引入羧基再与载体蛋白氨基反映，形成半抗原—蛋白偶合物：

(十一)对-肼基苯甲酸法
带酮基半抗原也可以与对—肼基苯甲酸反映，引入羧基，再按常法与载体蛋白交联；

(十二)．叠氮化法[4]
羧酸甲酯衍生物经肼解、亚硝化，转变为叠氯化物，再与载体蛋白上氨基反映：

(十三)氯乙酸钠法
半抗原羟基与氯乙酸钠反映，形成羧甲基醚衍生物，再通过羧基与蛋白交联：

(十四)亚胺酸酯法
双功能试剂亚胺酸酯类如丙双亚胺酸二乙酯双盐酸盐可以与半抗原和载体蛋白氨基交联，中间介以一种三碳桥：

亚氨酸酯类水溶性良好，反映条件温和，与氨基反映选取性高，此类试剂最大特点是，可与蛋白分子上赖氨酸残基广泛反映，而不影响蛋白分子净电荷变化。具备不同碳链长度亚氨酸酯可将半抗原间以一定距离与蛋白连接。
(十五)卤代硝基苯法
双功能试剂二硝基二氟苯或二氟二硝基苯砜分子中氟原于，由于邻近硝基活化作用，易和半抗原或载体蛋白上亲核基团如氨基、羟基、巯基等反映：

(十六)Mannich反映法
酮、酚类半抗原，可以用Mannich反映引入羧基，然后与常法与蛋白交联；

(十七)苯醌法

交联过程分两步进行，第—步反映完毕后，分离除去过量试剂，再进行第二步反映。
(十八)E11man试剂法[5]
E11man试剂即5．5’—二硫—2，2’—双硝基苯甲酸(DTNB)，该试剂可以与巯基作用，交联反映分两步进行：

本法用于游离巯基保护和活化，以便与游离巯基另一蛋白分子进行巯基互换反映。

(十九)马来酰亚胺基类活泼酯法
马来酰亚胺基构造中双键比较活泼，可与游离巯基进行选取性加成反映。马来酰亚胺基取代羧酸衍生物N-羟基琥珀酰亚胺酯试剂与含氨基药物或蛋白反映，引入马来酰亚胺基，与另—具有游离巯基分子通过巯基对双键加成反映连接起来。
这是一组异型双功能交联剂，惯用有N—羟基琥珀酰亚胺基—间—(N—马来酰亚胺基)-苯甲酸酯（SMB），N—羟基琥珀酰亚胺—4—(N—马来酰亚胺基) -苯丁酸酯（SMPB）等。

(二十)SPDP试剂法[6]
异型双功能交联剂N-羟基琥珀亚胺基-3—(2-吡啶基二硫)—丙酸酯(SPDP)可以通过其分子中活泼酯组份与氨基反映，也可以通过2—吡啶二硫基团与脂肪硫醇反映.SPDP可以于蛋白分子中引入巯基，然后运用巯基互换反映或巯基加成反映与另一分子交联：

这是当前较为惯用一种交联剂，交联反映条件温和，副反映较少，可以定量地于蛋白分子中引入保护巯基，且可以以便地测定其含量。同类交联剂尚有N—羟基琥珀酰亚胺—(4—a—甲基—a—(2—吡啶基—二硫代甲基)—苯甲酸酯(SMPT)[7]和N—羟基琥珀酰亚胺—3—(2—毗啶二硫)—丁酸酯(SPDBt[8])。通过在二硫键a—位引入位阻性基团如甲基，可以增长交联物中二硫键稳定性。

(二十一)苯丁酸氮芥衍生物法[9]
苯丁酸氮芥N—羟基琥珀酰亚胺基酯或混合酸酐衍生物分子中活性羧基和氮芥基可以分别与两个蛋白分子中氨基反映，将两者连接起来：

在中性及微碱性pH条件下,氮芥基倾向于与巯基反映，而在较高pH时倾向于与氨基反映。
(二十二)卤代乙酰衍生物法
卤代乙酸活泼酯衍生物如N—羟基琥珀酰亚胺基碘代乙酸酯分子中活泼酯成分和α—位活泼卤素可以分别与蛋白分子中巯基及氨基反映，实现两种分子交联：

本交联反映迅速，具备较高选取性，形成硫醚键在血浆中十分稳定。
(二十三)双马来酰亚胺试剂法[10]
此类试剂代表为N,N’—邻苯基双马来酰亚胺，可以连接两个含巯基分子。

这是一类比较温和交联剂，具备较高反映选取性，但是易形成同类分子交联产物。
(二十四)三氯三嗪试剂法
三氯三嗪分子可以与含羟基分子反映,剩余第二个氧原子活性稍低，可为蛋白分子上氨基取代，实现两分子交联：

必要注意，第一种分子中不能具有氨基及巯基等亲核性较强基团，否则，易形成自身聚合。
二、交联办法选取及偶合物设计

如上所述，蛋白质交联办法类型繁多，虽然可以满足各方面需要，但也增长了使用者选取困难。评价某一交联办法时，应当考虑如下关于因素：①交联反映效果，如交联产物构成均一性;②交联反映产率;③交联过程对生物活性影响；④交联操作简便性；⑤交联产物纯化难易；⑥交联反映成果可重复性；⑦偶合物使用目。抱负交联办法应当保证结合物得率较高，结合物构成均一，结合比适当，最大限度地保持生物活性，操作以便，纯化容易；在同样条件下，重复性好。
然而，当前还没有一种交联办法可以同步满足上述规定。由此，必要依照结合物使用目，权衡不同办法优缺陷来选取适当交联办法；最佳同步使用几种交联办法进行比较，择其优者而用之。
在人工抗原制备中，重要规定制备人工抗原保持半抗原构造特异性；所用交联办法不要明显变化半抗原构造，要保存抗原决定簇。必要时可在半抗原与载体之间引入一定碳链长度桥构造，暴露抗原决定簇，以利于产生针对半抗原抗体。
影响人工抗原免疫效果另一重要因素是每分子载体上结合药物分子数。普通以为药物结合量越大越好，但最佳结合比也取决于半抗原本质及载体性质。由于抗体特异性重要针对半抗原分子中远离偶联键构造，因而，在设计人工抗原结合物时，应选取远离半抗原特性构造基团进行交联。例如，与抗—睾酮—17—牛血清白蛋白相比，抗—睾酮—3—牛血清白蛋白可以更好地辨认类似构造甾体化合物。通过桥构造将载体蛋白连接于抗原分子中非生物特异性位置如雌激素C—6位，黄体酮C—6或C—11位，制备人工抗原结合物具备更好特异性。由这些结合物产生抗体可以辨认半抗原所有构造特性。
相应地，抗半抗原抗体对结合部位或邻近结合部位构造变化是不敏感，如3-羧甲基吗啡—蛋白结合物诱生抗体不能区别吗啡和可待因[11]。还原青蒿素—蛋白结合物所诱生抗体可以用于测定青蒿素、蒿甲醚及青蒿酯[12]。而通过不同办法制备安定两种蛋白偶合物所产生抗体，都能特异性地辨认安定。这些性质给人工抗原制备带来极为有利条件，人们可以恰当变化半抗原结合部位构造或引入交联活性基团，使制备人工抗原办法更加多样化。

对于酶标抗体制备，最重要是同步保持酶和抗体生物学活性，制备化学组份均一结合物。异型双功能交联试剂应用，基本实现了交联反映控制进行，减少或避免了自身聚合和交叉聚合，保证了交联产物有效性。
对于载体药物，一方面规定其可以在体内定量或定位地释放出具备生物活性游离药物。为此，连接药物与载体偶合键必要可以在一定条件下以一定速度解离，并且解离速度可以通过pH变化或体内不同组织小环境差别(如酶种类或活性)得到调控,以达到定向给药目；在制备载体药物结合物时，对药物分子构造不适当作永久性变化，以免引起生物活性变化；另一方面还规定每一载体能结合足够量药物分子，以保证给药效率。

在抗体导向药物设计和制备中应当考虑如下几点：①细胞毒分子—抗体偶合物在到达作用部位此前保持稳定，在血浆中不被降解；②结合物特异性可以反映载体特异性，即具备原载体专一性辨认和结合伙用；⑤结合物到达作用部位后来，能以某种方式进入细胞，发挥药理作用，即结合物自身具备细胞毒活性或结合物进入细胞后可以释放活性形式药物。
因而，对细胞毒分子中药物活性所必须部位不适当作不可逆化学修饰，并且偶联键要远离活性部位，以避免立体位阻对生物活性影响。如甲氨蝶呤分子中蝶呤某些对二氢叶酸还原酶有高度亲和性，是抗代谢活性必须构造，对其进行任何变化，均可导致药物活性丧失；但是，远离蝶呤谷氨酸残基，对酶抑制活性影响不大，可以用作交联基团。又如将细胞毒分子连接于抗体分子中远离抗原结合位点Fc区，可以最大限度地保持抗体活性[13]。
运用血浆与溶酶体pH差别，设计pH敏感偶联键，制备药物载体偶合物，可以实现药物控制释放[14,15]。如柔红霉素通过顺—乌头酸与蛋白形成结合物，在生理pH时稳定；而进入细胞后，可以在溶酶体酸性条件(pH4~5)下解离，释放柔红霉素原型药物分子，发挥细胞毒作用[14]。
无论使用哪种蛋白载体，其所能提供交联基团是相似。因而，交联办法选取以及交联物设计重要取决于半抗原或药物分子上功能团构造，下面就依照这些功能团分类，分别讨论不同交联办法应用。
(—)羧基
药物或其衍生物分子上羧基可以通过碳二亚胺法、混合酸酐法等与蛋白上氨基形成酰胺键，其中碳二亚胺法在此类化合物偶联反映中应用最为广泛。血管紧张素和缓激肽、促胃液素、吗啡、前列腺素、托普霉素、1—B—E—阿糖呋喃胞嘧啶、强松—21—琥珀酸半酯等均可在水溶性碳二亚胺EDC作用下，与蛋白或多聚氨基酸等载体结合，制备人工抗原。许多含羧基抗肿瘤药物如甲氨蝶呤[2]、苯丁酸氮芥、柔红霉素[3]二元酸单酯衍生物、丝裂霉素C—戊二酸单酯[16]、新制癌菌素[17]和磷酸酯酶C等均可在EDC作用下与抗体偶联，制备抗体导向偶合物。
同步具有氨基和羧基小分子，可以先将氨基保护后，再用羧基与载体交联，以避免自身缩合，交联反映完毕后再脱保护，游离氨基。不溶于水药物可先以二甲基甲酰胺溶解，然后再加于蛋白水溶液中，进行交联反映。
为了减少蛋白分子间自身聚合，可以先将药物分子上羧基转化为N—羟基琥珀酰亚胺活泼酯，然后再与抗体交联。例如，将丝裂霉素C—戊二酸单酯转化为活泼酯后，再与抗体交联，可以提高蛋白回收率和产品均一性，更好地保持抗体活性[18]。类似地，可以制备D，L—10，11—环氧麝子油酸及蜕皮激素人工抗原结合物。
混合酸酐法也能用于形成酰胺键。通过混合酸酐法与蛋白载体交联半抗原有考松—21—琥珀酸半酯、尿核苷—5’—磷酸、睾酮—17—琥珀酸半酯、3—O—琥珀酰毛地黄毒甙配基、胆酸、甲状腺素及利血平等。
药物及半抗原羧酸酯、活泼酯或酸酐衍生物可以与肼反映，转化为相对稳定酰肼物。后者在水性介质中，很容易和蛋白分子上醛基或酮基(由高碘酸钠氧化IgG分子上糖残基产生)反映，形成腙构造结合物。
此外，药物分子中羧基还可以转变为酰基叠氮衍生物，然后再与蛋白分子上氨基反映，形成以酰胺键连接结合物，酰基叠氮衍生物可以由酰肼与冷亚硝酸反映制备，也可以通过酰氯与叠氮钠反映产生。通过这种办法与蛋白交联有阿斯匹林、去乙酰长春花碱、甲状腺素等。
(二)氨基
含氨基半抗原及药物可以分为两类，即芳香胺类和脂肪胺类。这两类胺交联办法有所不同，下面分别讨论。
许多芳香胺类化合物可以在低温条件下与亚硝酸反映形成重氮盐，然后与载体蛋白分子上酪氨酸或组氨酸残基反映，形成以偶氮键交联结合物。芳香环上含硝基化合物如氯霉素，可将硝基还原为氨基后，再制备重氮盐，与蛋白载体结合。但是，重氮盐交联法存在难以克服副反映，可导致蛋白大量沉淀；并且，与重氮盐反映酪氨酸和组氨酸残基多存在于IgG分子中抗原结合区及其附近，因而交联反映易导致抗体活性损失。因此这一办法一船不用于抗体导向药物制备中。
脂肪胺类化合物可以在水溶性碳二亚胺作用下，与载体蛋白上羧基结合。用此办法连接半抗原有缓激肽、血管紧张素、托普霉素、庆大霉素、阿霉素、5-羟色胺及精脒等。脂肪胺还可以与一硝基苯甲酰氯反映，形成对-硝基苯甲酰衍生物，再将硝基还原为氨基后，通过重氮化与载体蛋白结合，以此法交联半抗原有烟草花叶病病毒蛋白及血管紧张素等。通过双功能交联剂苯甲基二异氰酸酯将胺类化合物与蛋白上氨基连接，可以制备缓激肽人工抗原结合物。药物分子上胺基还可以通过戊二醛试剂与蛋白分子上氨基结合，由此可以制备促肾上腺皮质激素、高血糖素及支甲肾上腺素等到人工抗原结合物和阿霉素-抗菌素体导向偶合物[44]。
以上交联办法均是运用同型双功能交联剂连接两分子上氨基。在交联过程中，不可避免地会形成某些相似分子间聚合产物。为了达到控制交联目，可以运用多元酸酐法，于含氨基半抗原分子上引入游离羧基,然后再以活泼酯法或碳二亚胺法与蛋白交联。如先将柔红霉素与琥珀酸酐或顺—乌头酸酐反映，再运用引进羧基与抗体上氨基反映，形成抗体导向偶合物[8]。也可以通过与SPDP反映，于半抗原分子上引入巯基，运用巯基反映与抗体交联。
(三)羟基
具有羟基半抗原分子涉及醇类、酚类、糖类及核苷酸类。在此类化合物交联中，普通先要制备其衍生物，以引进可以与蛋白反映功能团。例如，甾体化合物可以通过与琥珀酸酐反映，形成琥珀酸单酯衍生物，然后按羧基交联办法与蛋白偶联。按照类似办法可以制备环腺苷酸、雌酮、B—dl美沙醇、3—羟基氯硝安定、蜕皮甾酮、心得安、A9—四氢大麻酚及1—B—D—阿糖呋喃胞苷蛋白结合物。也可以将醇羟基与光气反映，制备高度反映活性氯甲酸酯，然后在碳酸氢盐存在下与蛋白分子上氨基交联。
三氯三嗪或羧甲基取代二氯三嗪试剂可以连接药物分子上羟基与蛋白分子上氨基，交联分两步进行，羟基化合物先与三嗪试剂反映，形成醚衍生物；剩余取代氯反映活性较差，不能再羟基取代，但可与亲核性较强蛋白氨基反映，由此形成通过三嗪核偶联结合物。双功能交联剂卤代硝基苯也可以用于连接药物分子上羟基和蛋白分子上氨基。
酚类化合物可以通过与重氮化-氨基苯甲酸反映，引入羧基，然后运用羧基反映与蛋白交联。这一类型反映被成功地用于制备17，B—雌二醇及()7- 四氢大麻酚人工抗 原结合物。
具备邻二醇构造核苷或核苷酸类化合物，可用高碘酸盐氧化出醛基，后者可以与蛋白分子上氨基反映形成Schiff氏碱，以硼氢化钠还原后即可得到稳定以碳—氮单应过程中，毋需分离中向产物，本法成功地用于制备地高辛及G-毒毛旋花子甙蛋白结合物。改进法被用于制备碱敏感性核苷及核苷酸结合物。用高碘酸盐氧化法制备抗体导向偶合物有柔红霉素—右旋糖苷—抗体结合物及柔红霉素—抗体 偶合物。后者是通过氧化右旋糖苷上邻二醇为醛基，运用醛基分别连接药物和抗体分子上氨基制备而成。但本法也可以产生副产物，并且硼氢化还原也许破坏药物构造，影响药物活性[19].用高碘酸钠氧化抗体IgG分子Fc端糖基，运用生成醛基与氨基化合物交联。这样，将细胞毒组份区域选取性地连接于远离抗原结合位点Fc端，可以更好地保持抗体活性。
(四)羰基
醛基化合物如吡哆醛及毗哆醛磷酸酯可以通过与蛋白分子上氨基形成Schiff氏碱，实现与蛋白交联。醛或酮均可以通过与O—羧甲基—羟胺反映，转化为O—羧甲基—肟衍生物,引入一种羧基，通过形成酰胺键与蛋白交联。以这种办法交联半抗原分子有睾酮、孕酮、雌酮及18—乙基炔诺酮。醛固酮及考松等与对—肼基苯甲酸反映，再运用引入羧基与牛血清白蛋白交联。在羰基。位引入一种卤素原子，再与蛋白分子中氨基反映，可形成碳—氮单键交联产物。如14—溴代柔红霉素在微碱性条件可与蛋白IgG结合，形成抗体导向偶合物[20]。
(五)巯基
青霉烯酸分子上巯基，可以与蛋白分子中引入巯基反映，形成以二硫键交联结合物。6，β—溴—孕酮及14—溴代柔红霉素[3]可以与蛋白分子中引入巯基反映形成以硫醚键连接结合物。
运用巯基反映进行偶联办法重要用于蛋白毒素与抗体偶联，形成免疫毒素。普通来说，巯基可以通过二硫互换反映形成二硫键，或通过与马来酰亚胺基上双键加成反映形成硫醚键，实现毒素与蛋白连接。类似交联办法同样可以用于制备酶标抗体。
由于蛋白质分子中普通没有巯基反映活性基团，因而，巯基互换反映具备较好选取性，在一定限度上避免相似分子间聚合，并且通过定量引进巯基及巯基反映活性基团，可以实现控制交联，以得到化学专一性和生物专一性更好交联产物。
毒素或抗体分子可以与SPDP、2—亚胺基四氢噻吩十4，4’—二硫吡啶、3—(4’—二硫吡啶基)—丙酰亚胺甲酯等反映，引入保护性巯基—二硫吡啶基(一S—S一 )，后者可以通过巯基互换反映与另一蛋白分子上巯基形成二硫键。蛋白分子中巯基可以由二硫毗啶基还原产生，也可以通过与2—亚胺基四氢噻吩、3—巯基丙酰 亚胺甲酯、N—乙酰同型半肮氨酸硫代内酯或S—乙酰硫代琥珀酸酐等试剂反映引入。运用马来酰亚胺基活泼酯试剂或碘代乙酸活泼酯于蛋白分子中引入巯基反映活性马来酰亚胺双键或碘乙酰基，然后与另一蛋白分子中巯基进行加成反映或取代反映，形成以硫醚键连接偶合物。
三、结合物纯化与鉴定
蛋白质交联反映中小分子如未结合药物、交联剂、反映副产物可以通过凝胶柱层析、透析或硫酸铵沉淀法与高分子结合物分离。对于蛋白—蛋白交联产物，可以依照产物和反映物分子量大小，选用适当凝胶柱层析，将交联产物与未反映蛋白分离。为了获得分量更均一产物，也可以采用高效液相层析、电泳及离子互换柱层析进行分离纯化。
对于蛋白结合产物，一方面必要测定其中各组份含量。惯用测定办法有：1两种组份吸取光谱不重叠者，可以选取适当波长分别测定OD值，计算两组份摩尔浓度，推算结合比。普通运用280nm处特性吸取，测定蛋白含量；2载体蛋白具有一定数目游离氨基，与含羧基药物交联后，游离氨基必将减少，可以用三硝基苯磺酸法或二硝基苯酚法测定交联先后氨基含量，推算结合比：3在交联过程中加入一定量放射标记药物或蛋白，通过测定结合物放射比活性，计算结合比；4将结合物水解后，运用药物所特有颜色反映，测定解离药物含量；或者运用考马斯亮蓝法及福林—酚法测定蛋白含量；5对于蛋白—蛋白结合物，可以通过SDS—PAGE电泳测定结合物分子量，推算结合比。

参照文献
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第二章 配体结合分析中蛋白质连接技术
一酶对抗原、半抗原、抗体标记一
洪 孝 庄
(军事医学科学院毒物药物研究所)
一、总 论
自从60年代初Yalow和Berson首创放射免疫分析办法(Radio—immunoassay，RIA)以来，以放射性同位素或非放射性标记物为工具一大类分析办法迅速发展。当前，巳初步形成一种新颖分析技术系统——配体结合分析(Ligand Binding Assay)，这是一类敏捷度高、特异性强分析系统，已在生物医学各关于研究领域广泛应用。
(一) 配体结合分析概念及分类
1．配体 (Ligand) 指凡能与生物大分子某一构造上特定部位发生互补结合分子或化合物，它们对生物大分子具备高度专一性和很强亲和力。在分子药理学研究中，配体系指与受体(Receptor)结合活性信号分子。当前，配体一词应用广泛，它可以是小分子物质，也可以是大分子物质，如酶与底物，酶与抑制剂或辅酶，抗体与抗原或半抗原，受体与药物或激素等。从广义上讲，它们之间可互称为配体，如抗原是抗体配体，反之，抗体亦可称为抗原配体。
2．配体结合分析 运用生物大分子与其配体间高度特异性亲和反映作为工具，进行定量分析一类办法。以酶免疫分析(Enzyme lmmunoassay，EIA)为例，是以酶标记抗原(或半抗原)和非标记抗原(或半抗原)对专一性抗体竞争性结合反映为基本，其中抗原—抗体之间免疫反映通式如下：
Ag十Ab—＞Ag—Ab
当用酶标记抗原(E—Ag)检测非标记待测抗原(Ag)时，两者便与其特异抗体(Ab)发生竞争结台作用，此即为竞争性酶免疫分析理论基本：
(E—Ag)十Ab——，(E—Ag)一Ab
(F) 十 (B) 、
Ag

Ag-Ab
游离(F)与结合(B)某些分离后，测其中(F)a或（B）分酶活性，则与待测非标记抗原量成比例。此类分析办法专一强、敏捷度高、操作简便，在分子生物学、生化药理、免疫药理及临床医学研究中易于采用。
3.配体结合分析类型 在配体结合大分子生物活性物质称为结合剂。惯用结合剂有酶、抗体、受体和特异结合蛋白等(表2—1)。

当前，依照所用结合剂不同，可将配体结合分析分为三大类：①以抗体为结合剂者为免疫分析；②以受体为结合剂者为受体分析；③以特异结合蛋白为结合剂者为竞争蛋白结合分析。
如下简要列出上述三类配体结合分析重要办法：
(1)免疫分析(Immunoassay)
A．放射免疫分析(1,2)
B．酶免疫分析:
a．非均相酶免疫分析(Heterogeneous Enzyme Immunoassay)或称酶联免疫吸附实验(Enzyme Linked Imunosorbent Assay，ELISA)；
b．均相酶免疫分析(Homogeneous Enzyme Immunoassay)或称酶放大免疫测定技术(Enzyme Multipled Immunoassay Technique，EMIT)[3]；
C，荧光免疫分析(F1uoroimmunoassay，FIA)[4]；
D．发光免疫分析(Luminescent Immunoassay，LIA)[5]：
a．生物发光免疫分析(Bi0luminescent Immun0assay，BLIA)；
b．化学发光免疫分析(Chemiluminescent Immunassay，CLIA)；
E．无标记免疫分析(Marker-free Immunoassay)[6，7]：
a。胶乳凝集免疫分析(Agglutination Latex Immunoassay)；
b。颗粒计数免疫分析(Particle Counting Immunoassay，PACIA)；
F．仪器免疫分析：
a。激光浊度免疫分析(Laser NephelometriC Immunoassay，lNIA)；
b．荧光偏振免疫分析(Fluorescence P0larization Immunoassay，FPIA)；
(2)受体分析(Receptor Assay)[8]。
A．放射受体分析(Radio Receptor Assay，RRA)；
B．酶受体分析(Enzyme Recept0r Assay，ERA)[9,10]；
(3)竞争蛋白结合分析(CompetitiYe Protein Binding Assay，CPBA)[11]
(二)配体结合分析中标记(即蛋白连接)技术
1．标记物种类
(1)放射性同位素：3H、125I；
(2)非放射性标记物
1) 酶、辅酶、酶抑制剂；
2) 荧光、生物发光及化学发光物质；
3) 金属原子；稳定自由基；
4) 红细胞、噬菌体；胶乳(Latex)； 。
5) 毒素：白喉毒素、蓖麻毒素及红豆毒素等，此类物质不是用于配体结合分析标记物，而是用于免疫毒素制备。
2．标记对象(被标记物) *表达被标记物
(1)生物大分子(绝大多数为蛋白质)
1) Ag或*Ab(●抗原或●抗体)；
2) L—*R(配体—●受体)；
3) Biotin—*Avidin(生物素—●抗生物