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杏鲍菇胞外多糖液体发酵条件优化

摘要 杏鲍菇是一种品质优良的名贵珍稀食用菌，有很高的营养和食用价值，其营养成分丰富，多糖含量在食用菌中位于前列。相关研究已经证明杏鲍菇多糖具有降血脂等生物功能，因此通过液体发酵获得较高的杏鲍菇胞外多糖产量具有实际意义。本研究以杏鲍菇菌丝体为实验对象，通过五个单因子实验确定杏鲍菇菌丝体发酵获得胞外多糖产量最高的培养基组分。实验结果显示最佳碳源、氮源、无机离子、pH值和培养时间，依次分别为半乳糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、6.0和9天。在单因子实验的基础上，本文通过四因素三水平的正交实验得到杏鲍菇胞外多糖产率最高的培养基配方应为半乳糖 30 g/L，蛋白胨 5 g/L，磷酸二氢钾 3 g/L且初始pH调节至6.0，按照上述条件可得到的杏鲍菇胞外多糖得率为 5.92±0.84 g/L。

关键词 杏鲍菇；胞外多糖；培养基优化

Abstract Pleurotus eryngii is a kind of rare and precious fungus which has high nutritional and edible value. Further more, it is rich in polysaccharide content, which has been proved recently to have lipid-lowering power in blood. Therefore, the study of fluid medium optimization of P. eryngii for the improvement of the production of extracellular polysaccharide is full of practical significance. In this study, we treat mycelium as experimental subject, and carry out five single factor experiments to find out the best medium components, which are galactose as the best carbon source, peptone as the best nitrogen source, potassium dihydrogen phosphate as the best inorganic ions, 6.0 as the most suitable pH value and 9 days as the incubation time. Based on the single factor experiments, we proceed to an orthogonal experimental design which has four factors and three levels of each factor, and through this experiment we find out the optimal medium for the largest production of P. eryngii extracellular polysaccharide, which is galactose 30g/L, peptone 5g/L, potassium dihydrogen phosphate 3g/L and the initial pH value should be adjusted to 6.0. Under such conditions, the ratio of production of P. eryngii extracellular polysaccharide is 5.92±0.84g per liter of fermentation liquor.

Keywords Pleurotus eryngii；extracellular polysaccharides；fluid medium optimization

目录

1 引言 1
2 材料与方法 3
2.1 主要材料与试剂 3
2.1.1 生物材料 3
2.1.2 试剂 3
2.1.3 培养基 3
2.2 主要设备 3
2.3 试验方法 3
2.3.1 菌种活化 3
2.3.2 碳源单因子实验 4
2.3.3 氮源单因子实验 4
2.3.4 无机离子单因子实验 4
2.3.5 pH值单因子实验 4
2.3.6 培养时间单因子实验 4
2.3.7 液体发酵培养条件正交试验 4
2.3.8 杏鲍菇菌丝体生物量测定 4
2.3.9 杏鲍菇胞外多糖的提取及定量 5
3 结果与讨论 6
3.1 单因子实验 6
3.1.1 碳源单因子实验 6
3.1.2 氮源单因子实验 7
3.1.3 无机离子单因子实验 9
3.1.4 pH值单因子实验 10
3.1.5 培养时间单因子实验 11
3.2 正交试验 13
4 结论 14
致谢 15
附录 16
毕业论文相关外文文献翻译 16
参考文献 19

1 引言
食用菌是一类可供食用的具有子实体的大型真菌，过去被称为“山珍”，被誉为最理想的保健食品。其中绝大多数属于担子菌类，少数属于子囊菌。全球可食用的真菌有2000多种。我国目前能进行人工栽培的食用菌有80多种，其中可进行商业化栽培的仅30余种[1]。
本文所关注的杏鲍菇（学名：Pleurotus eryngii），又称刺芹菇、刺芹侧耳，，隶属于担子菌亚门(Basidiomycotina），层菌纲(Hymenomycetes)，无隔担子菌亚纲(Homobasidiomycetidae)，伞菌目(Agaricales)，侧耳科(Pleurotaceae)，侧耳属(Pleurotus)。杏鲍菇属于侧耳属的最大一个种。杏鲍菇的名字源于其菌肉肥厚、营养丰富，具有杏仁的香气和鲍鱼的口感，是一种品质上佳的名贵珍稀食用菌[2]。
杏鲍菇原产于欧洲地中海区域、中东和北非，但也在亚洲部分地区生长。1974年，Cailleux 用菌褶分离法获得杏鲍菇菌株并试栽成功。三年后，Ferri首先进行了商业性栽培的尝试。目前国内栽培的杏鲍菇多是上世纪九十年代后从欧洲引进的。
杏鲍菇菌丝白色，初期纤细，逐渐浓密蔓延。子实体单生或簇生，菌盖直径2～13厘米，初圆形，后变平，菌盖中央稍下凹，成熟时成漏斗状，表面干燥，灰褐色，菌盖边缘稍内卷，菌肉白色，具杏仁味，菌褶乳白色，延生，菌柄长5—15厘米，多偏生或侧生，也有中生，粗壮、先端细，中实，无菌环，孢子椭圆至纺锤形。
杏鲍菇的营养价值极高。氨基酸种类齐全，必需氨基酸所占比例高，特别是普通膳食中缺乏的赖氨酸、精氨酸含量丰富，同时钙、镁、钾、磷等无机元素含量也相当丰富，而脂肪含量偏低，因寡糖含量丰富，与双歧杆菌共用，具有整肠美容的效果，是一种理想的保健食品，早已受到国内外消费者的青睐。杏鲍菇是联合国粮农组织向各国推荐的食用菌品种，被列为21世纪最具开发潜力的十种食用菌之一。
本文对于胞外多糖的关注，顺应了多年来糖生物学的迅猛发展[3]。糖类是地球生物不可缺少的化学物质，其最简单的形式成为生物体赖以生存的主要能源，但其最主要的生物学功能则是以糖复合物或者多糖的形式出现的[4]。1988年牛津大学德威克教授在当年的《生化年评》杂志中撰写了以“糖生物学”为题的综述，这标志了糖生物学这一新的分支学科的诞生。糖生物学是糖的化学和生物学研究相结合而产生的一门新兴学科，主要研究糖缀合物糖链的结构、生物合成和生物学功能，其研究领域包括糖化学、糖链生物合成、糖链在复杂生物系统中的功能和糖链操作技术等[5]。近几十年来，随着糖化学、糖生物学、糖工程学、分子生物学及现代分析技术的建立和发展，针对多糖的研究方法和技术有了长足的进步。人们逐步认识到多糖物质具有重要的生物学功能，涉及到有机体生命活动的整个时空序列，如：受精、着床、分化、发育、免疫、感染、癌变和衰老等[6]。20世纪90年代以来，多种新方法、新技术被应用于多糖物质的研究中，一些不同生理活性的多糖物质被分离、纯化和鉴定，部分研究成果所形成的产品已投放市场，并显示出良好的经济效益[2]。
现代药理学研究表明，杏鲍菇中所含的真菌多糖能增强肌体免疫功能[7]，具有抗病毒，降低机体胆固醇含量，防止动脉硬化等功能[8]。在杏鲍菇多糖的生物活性方面，也开展了较为深入的研究[9, 10]。杨立红[11]等以杏鲍菇子实体为材料，分离纯化了杏鲍菇多糖，并利用MDA(丙二醛)、GSHOPX(谷胱甘肽过氧化物酶)活力、血清GBT(谷丙转氨酶)活力、GOT(谷草转氨酶)活力、GK(肌酸激酶)活力等指标研究杏鲍菇多糖对力竭小鼠自由基代谢及心肌、肝脏、骨骼肌损伤的影响，以观察杏鲍菇多糖抗氧化、抗损伤功效[12]。张俊会[13]等研究报道了杏鲍菇发酵多糖对亚油酸、菜油氧化以及离体肝脏组织的脂质过氧化均有一定抑制作用。
本文所涉及的发酵技术为液体发酵[14]，液体发酵是食药用菌液体培养的一种，它是将菌种培养在发酵罐或锥形瓶内，通过不断通气搅拌或振荡，使菌体在液体深层处繁育的方法[15]。通过液体深层培养即发酵的方式生产食用菌菌球，作为食用菌栽培的种子或作为有效成分提取分离及深加工的原料。液体发酵技术属于现代生物技术之一，它比传统的食(药)用真菌栽培生产技术具有明显的优越性：周期短、成本低、产量大，且有工厂化生产前景[16]。
本实验立足于杏鲍菇卓越的保健功效和正在不断发现中的各种生物学活性，着眼于杏鲍菇液体发酵产生的胞外多糖产量，通过单因子实验与正交试验的组合，以期筛选出杏鲍菇液体发酵胞外多糖产量最高的碳氮源、无机离子和酸碱度的组合[17]。该试验的结果将对食用菌来源的抗氧化、降血脂等保健产品的生产、开发具有一定的指导意义，为杏鲍菇多糖衍生食品和药物开发提供前期的理论和实验依据，令杏鲍菇及其多糖产品为人类的健康做出更大的贡献，产生更多的经济效益。

2 材料与方法
2.1 主要材料与试剂
2.1.1 生物材料
杏鲍菇菌种：购自江苏省农科院。
2.1.2 试剂
2.1.2.1 供试碳源
D-木糖，D-果糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-甘露糖，半乳糖，鼠李糖，乳糖，麦芽糖，蔗糖，D-甘露醇，可溶性淀粉，D-山梨醇，糊精。
2.1.2.2 供试氮源
蛋白胨，酵母提取物，牛肉膏，硫酸铵，尿素，胰胨，醋酸铵。
2.1.2.3 供试无机离子
七水合硫酸，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，氯化钾，氯化钙。
2.1.2.4 其他
盐酸，氢氧化钠，无水乙醇。
2.1.3 培养基
2.1.3.1 菌种保藏培养基：PDA斜面培养基
马铃薯 20%，葡萄糖 2%，琼脂 2%，pH 自然。
2.1.3.2 种子培养基：商品PDA培养基
称量出商品PDA培养基粉末46.0g（配方：马铃薯粉 6 g/L，葡萄糖 20 g/L，琼脂20 g/L，pH 5.6±0.2），加入 1000ml 蒸馏水中，115℃高压灭菌20分钟。
2.1.3.3 液体发酵培养基
葡萄糖 30 g/L，酵母提取物 5 g/L，蛋白胨 2 g/L，磷酸二氢钾 1 g/L，七水合硫酸镁 1 g/L，pH 自然。
2.2 主要设备
HYG-A全温摇床柜，无菌操作台，恒温磁力搅拌器，立式蒸汽灭菌器，电子分析天平，旋转蒸发仪RE-52，循环水真空泵，酸度计，冰箱，微波炉，超声波清洗器，电子天平。
2.3 试验方法
2.3.1 菌种活化
将保藏于斜面PDA培养基上的菌种转接于种子培养基上，25℃培养9天或至长满培养基。选择菌丝生长最为旺盛的平板备用。
2.3.2 碳源单因子实验
分别用D-木糖，D-果糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-甘露糖，半乳糖，鼠李糖，乳糖，麦芽糖，蔗糖，D-甘露醇，可溶性淀粉，D-山梨醇，糊精替代液体发酵培养基中的等量碳源，其余成分保持不变，制成碳源单因子实验培养基，每一配方有三次生物重复。每150 ml锥形瓶装入50 ml培养基，接种量10%，于25 ℃，150 r/min培养九天，最后测其生物量和胞外多糖含量。
2.3.3 氮源单因子实验
分别用蛋白胨，酵母提取物，牛肉膏，硫酸铵，尿素，胰胨，醋酸铵替代液体发酵培养基中的等量氮源，其余成分保持不变，制成氮源单因子实验培养基，每一配方有三次生物重复。每150 ml锥形瓶装入50 ml培养基，接种量10%，于25 ℃，150 r/min培养九天，最后测其生物量和胞外多糖含量。
2.3.4 无机离子单因子实验
分别用七水合硫酸，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，氯化钾，氯化钙替代液体发酵培养基中的等量无机离子，其余成分保持不变，制成无机离子单因子实验培养基，每一配方有三次生物重复。每150 ml锥形瓶装入50 ml培养基，接种量10%，于25 ℃，150 r/min培养九天，最后测其生物量和胞外多糖含量。
2.3.5 pH值单因子实验
采用液体发酵培养基，将pH值分别调至5.0 、5.5 、6.0 、6.5 、7.0 ，误差不超过0.1，制成pH值单因子实验培养基，每一配方有三次生物重复。每150 ml锥形瓶装入50 ml培养基，接种量10%，于25 ℃，150 r/min培养九天，最后测其生物量和胞外多糖含量。
2.3.6 培养时间单因子实验
采用采用液体发酵培养基，将培养时间依次设置为7、8、9、10、11、12天，制成培养时间单因子实验培养基，每一配方有三次生物重复。每150 ml锥形瓶装入50 ml培养基，接种量10%，于25 ℃，150 r/min培养九天，最后测其生物量和胞外多糖含量。
2.3.7 液体发酵培养条件正交试验
利用单因子实验得到的最优碳源、氮源、无机离子和起始ph值四个因素，各取三个水平，进行正交实验。培养时间为九天。实验因素水平设计见表2-1。
表2-1 正交试验设计方案

A：碳源
B：氮源
C:无机离子
D：起始pH值
水平1
25g/L
5g/L
1g/L
5.5
水平2
30g/L
7g/L
2g/L
6
水平3
35g/L
9g/L
3g/L
6.5
2.3.8 杏鲍菇菌丝体生物量测定
培养九天的发酵液经纱布过滤，并用蒸馏水反复冲洗菌丝体，置于60摄氏度恒温烘箱中烘干至恒重，称重。生物量的计算依照如下公式：
菌丝生物量（mg/L）=菌丝体干重（mg） / 发酵液体积（ml） * 1000
2.3.9 杏鲍菇胞外多糖的提取及定量
本实验采用醇沉法提取杏鲍菇胞外多糖，具体的技术路线为：发酵液→过滤菌丝体→利用旋转蒸发仪浓缩至原体积的20%→缓慢加入无水乙醇至原体积，即终体积分数为80%→四摄氏度下冰箱冷藏过夜→离心弃去上清液→将沉淀置于烘箱内干燥至恒重→得到醇沉粗多糖。
多糖提取率的计算依照如下公式：
多糖提取率（mg/L） = 粗多糖干重（mg） / 发酵液体积（ml） * 1000

3 结果与讨论
食用菌液体发酵的技术关键在于培养基的选取，不同的菌种对于培养基的需求均有差异。本文通过单因子实验结合正交试验，以期得到胞外多糖产量最高的杏鲍菇液体深层发酵培养基配方。
3.1 单因子实验
3.1.1 碳源单因子实验
碳源单因子的实验结果如表3-1，表中分别显示了其生物量和多糖提取率。不同碳源对于菌丝体质量和多糖产量的影响如条形图3-1与3-2。
在选取被试碳源时，我们考虑到了不同类别的糖类对于胞外多糖产量的影响。其中包含有单糖（D-木糖，D-果糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-甘露糖，半乳糖，鼠李糖），二糖（乳糖，麦芽糖，蔗糖），多糖（可溶性淀粉，糊精）以及糖醇（D-甘露醇，D-山梨醇）。
在单糖中，最适碳源是半乳糖。二糖中，多糖产量最高的碳源是乳糖。多糖明显更利于真菌菌丝体的生长而不是产生胞外多糖。糖醇类则在菌丝体生长和产多糖两方面都不具有明显的优势。
因为本实验着眼于培养基各元素对于胞外多糖产量的影响，所以首要关注的是能提高胞外多糖产量的碳源。从碳源单因子实验的结果看来，杏鲍菇胞外多糖得率最高的是半乳糖，其次是葡萄糖，再次是乳糖。以半乳糖作为碳源，多糖得率较葡萄糖高出12%，较乳糖高出17%。
因此在后续试验中，半乳糖将作为最佳碳源加入培养基。
表3-1. 不同碳源对于杏鲍菇菌丝体生物量及多糖得率的影响
碳源
菌丝生物量 mg/L
多糖得率 mg/L
半乳糖
7054±12.58
2466.67±15.28
D-葡萄糖
7102±35.78
2200±17.32
乳糖
7049±2.29
2100±10.00
鼠李糖
6316±6.79
1900±35.36
D-山梨醇
7832±54.31
1900±21.21
麦芽糖
7025±21.99
1666.67±28.87
L-阿拉伯糖
5899±11.50
1600±10.00
D-甘露糖
6884±14.11
1533.33±5.77
D-木糖
5339±3.41
1450±9.57
蔗糖
8067±29.30
1333.33±5.77
D-果糖
7777±21.91
1200±10.00
D-甘露醇
7900±10.59
1000±12.50
可溶性淀粉
9867±123.39
200±23.40

图3-1. 不同碳源对于杏鲍菇菌丝体质量的影响

图3-2. 不同碳源对于杏鲍菇胞外多糖产量的影响

3.1.2 氮源单因子实验
氮源单因子的实验结果如表3-2，表中分别显示了其生物量和多糖提取率。不同氮源对于菌丝体质量和多糖产量的影响如条形图3-3与3-4。
供试氮源有无机氮源（硫酸铵，醋酸铵）和复杂有机氮源（蛋白胨，酵母提取物，牛肉膏，尿素，胰胨）。结果显示无机氮源无法促进菌丝体良好地生长，有机氮源在菌丝体生长方面普遍效果显著，尤其是酵母提取物和牛肉膏。但在胞外多糖的获得率方面，有机氮源蛋白胨的效果显然要更加理想，其多糖的得率显然要远远高于后面几种备选的氮源。
因此，在后续实验中，蛋白胨将作为最佳氮源加入培养基。
表3-2. 不同氮源对于杏鲍菇菌丝体生物量及多糖得率的影响
氮源
菌丝生物量 mg/L
多糖得率 mg/L
蛋白胨
6377±9.09
2243.5±8.11
牛肉膏
11331±50.72
2100±21.68
酵母提取物
11573±20.86
1710±16.55
胰胨
4188±11.88
1412.67±34.55
尿素
5269±3.90
771±6.05
醋酸铵
2817±6.89
734.5±7.55
硫酸铵
5355±7.92
760±46.16
图3-3. 不同氮源对于杏鲍菇菌丝体质量的影响

图3-4. 不同氮源对于杏鲍菇胞外多糖产量的影响

3.1.3 无机离子单因子实验
无机离子单因子的实验结果如表3-3，表中分别显示了其生物量和多糖提取率。不同无机离子对于菌丝体质量和多糖产量的影响如条形图3-5与3-6。
在无机离子的单因子实验中我们主要考虑了大量元素，而痕量元素因为在液体药瓶中一般不添加而不在考虑范围之内。大量元素中，我们挑选了镁离子、钾离子和钙离子所谓主要的被试离子，其中钾离子考虑了其三种主要出现在培养基中的形式。
实验结果显示，钙离子显然最有利于菌丝体的生长，这与在大多数的真菌生长过程中钙离子都与菌丝体延长的生理过程有关。但在多糖产率方面，钾离子的效果明显好于其他两个被试离子。其中又以KH2PO3的效果最为卓著，其多糖得率较次佳无机离子K2HPO3高16.3%，比镁离子和钙离子分别高172.5%和203.3%。
因此，在后续实验中，KH2PO3将作为最佳无机离子加入培养基。
表3-3. 不同无机离子对于杏鲍菇菌丝体生物量及多糖得率的影响
无机离子
菌丝生物量 g/L
多糖得率 mg/L
MgSO4·7H2O
3794±39.88
2099.00 ±29.20
K2HPO3
4077±5.77
4918.67 ±17.83
KH2PO3
3264±13.69
5720.67 ±8.89
CaCl2
4678±17.68
1886.00 ±14.99
KCl
3551±7.30
940.67 ±15.81
Control
3813±10.55
558.67 ±5.09

图3-5. 不同无机离子对于杏鲍菇菌丝体质量的影响

图3-1. 不同无机离子对于杏鲍菇胞外多糖产量的影响

3.1.4 pH值单因子实验
pH值单因子的实验结果如表3-4，表中分别显示了其生物量和多糖提取率。不同pH值对于菌丝体质量和多糖产量的影响如条形图3-7与3-8。
可以看出杏鲍菇的菌丝体基本上对于pH值并不十分敏感，生物量和多糖得率在不同pH条件下相差并不显著，但是仍可以清晰地看出pH为6.0时，菌丝体生长地更好，且多糖得率也是最高的。
因此，在正交试验中，我们将以pH6.0为基准，看这一条件与其他条件是否能契合。
表3-4. 不同pH值对于杏鲍菇菌丝体生物量及多糖得率的影响
pH值
菌丝生物量 g/L
多糖得率 mg/L
5.0
7791±12.06
3800±10.00
5.5
7315±13.29
4066.67±11.55
6.0
9079±54.09
4400±0.00
6.5
8138±29.83
4000±25.82
7.0
8920±48.32
3333.33±102.14

图3-6. 不同pH值对于杏鲍菇菌丝体质量的影响

图3-7. 不同pH值对于杏鲍菇胞外多糖产量的影响

3.1.5 培养时间单因子实验
培养时间单因子的实验结果如表3-5，表中分别显示了其生物量和多糖提取率。不同培养时间对于菌丝体质量和多糖产量的影响如条形图3-9与3-10。
有条形图可以明显的看出，对于菌丝体生长而言，11天是最合适的长度，过长的时间可能导致菌丝体快速老化，果断的时间菌丝体还有继续生长的潜力和空间。但对于多糖得率而言则并不尽然，第七天就已经出现的高峰可以解释为原来培养基中的糖尚未得到完全的消耗，因此糖含量非常高。而在第八点的拐点之后，我们看到9、10两天的多糖产量相近且均高于之前与之后的时间。
因此，从节约发酵时间的角度出发，在第九天与第十天多糖产量相差不大的情况下，我们认为最优的培养时间是九天。
表3-5. 不同培养时间对于杏鲍菇菌丝体生物量及多糖得率的影响
培养时间
菌丝生物量 g/L
多糖得率 mg/L
7
3809±11.37
2400±24.86
8
4351±12.33
2196.67±4.21
9
4039±21.68
2317.33±8.69
10
5709±22.59
2322.67±20.45
11
6398±43.98
1925.33±29.26
12
2893±31.90
1800±20.00
图3-8. 不同培养时间对于杏鲍菇菌丝体质量的影响

图3-9. 不同培养时间对于杏鲍菇胞外多糖产量的影响

3.2 正交试验
正交试验(Orthogonal experiment)是研究多因素多水平的又一种设计方法，它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点。正交试验是分析因式设计的主要方，是一种高效率、快速、经济的实验设计方法[18]。
正交试验的设计主要依据正交表。所谓正交表，也就是一套经过周密计算得出的现成的实验方案，这套方案的总实验次数是远小于每种情况都考虑后的实验次数的。比如3水平4因素表就只有9行，即需要九次实验，远小于遍历试验的81次；同理可推算出因素水平越多，试验的精简程度会越高。
本实验采取了四因素三水平的正交试验方案，四因素分别设置为碳源、氮源、无机离子和pH值。其中，前三者分别采用之前的单因子实验所得到的最优碳源、氮源和无机离子，依次为半乳糖、蛋白胨和磷酸二氢钾，而pH值则依据单因子实验得到的结果，分别加减0.5设置水平。
正交试验结果及相关分析如下表所示：
表3-6. 正交试验结果及分析表
序号
半乳糖
g/L
蛋白胨
g/L
磷酸二氢钾 g/L
pH
胞外多糖质量 g/L
A
25
5
1
5.5
0.81 ± 0.17
B
25
7
2
6.0
1.15 ± 0.30
C
25
9
3
6.5
1.14 ± 0.03
D
30
5
2
6.5
1.69 ± 0.22
E
30
7
3
5.5
1.67 ± 0.45
F
30
9
1
6.0
0.96 ± 0.29
G
35
5
3
6.0
5.92 ± 0.84
H
35
7
1
6.5
2.45 ± 0.46
I
35
9
2
5.5
4.04 ± 0.33
K1
3.10 ± 0.50
8.42 ± 1.23
4.22 ± 0.92
6.52 ± 0.95

K2
4.32 ± 0.96
5.27 ± 1.21
6.88 ± 0.85
8.03 ± 1.43

K3
12.41 ± 1.63
6.14 ± 0.65
8.73 ± 1.32
5.28 ± 0.71

k1
1.03 ± 0.17
2.81 ± 0.41
1.41 ± 0.31
2.17 ± 0.32

k2
1.44 ± 0.32
1.76 ± 0.40
2.29 ± 0.28
2.68 ± 0.48

k3
4.14 ± 0.54
2.05 ± 0.22
2.91 ± 0.44
1.76 ± 0.24

R
3.11 ± 0.37
1.05 ± 0.01
1.50 ± 0.13
0.92 ± 0.24

最佳水平
35
5
3
6.0

上表中，K1，K2，K3分别为所在元素在三个水平上得到的多糖得率之和，k1，k2，k3则为所在列元素的多糖得率的平均值，R值为平均值的极差。
依据该正交试验结果表，由R值的变化可知四个因素的影响从大到小依次为A（碳源，半乳糖）>C（无机离子，磷酸二氢钾）>B（氮源，蛋白胨）>pH。
依据三个平均值的变化，可以得到最佳的条件组合为A3B1C3D2，也即在半乳糖浓度为30g/L，蛋白胨浓度为5g/L，磷酸二氢钾浓度为3g/L且初始pH调节至6.0时，杏鲍菇胞外多糖的产量最大，得率最高。

4 结论
本文以杏鲍菇菌丝体为实验对象，通过单因子实验确定杏鲍菇菌丝体发酵获得胞外多糖产量最高的碳源、氮源、无机离子、pH值和培养时间，分别为半乳糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、6.0和9天。
在单因子实验的基础上，本文通过正交实验得到杏鲍菇胞外多糖产率最高的培养基配方应为半乳糖 30 g/L，蛋白胨 5 g/L，磷酸二氢钾 3 g/L且初始pH调节至6.0，按照上述条件可得到的杏鲍菇胞外多糖得率为 5.92±0.84 g/L。

附录
毕业论文相关外文文献翻译
碳源、氮源和无机离子对于Psathyerella atroumbonata(Pegler)，一种尼日利亚食用真菌，生长的影响[17]
摘要：
我们研究了简单有机物、无机物和复杂组分对于Psathyerella atroumbonata(Pegler)，一种尼日利亚食用真菌，生长的影响。我们使用了多种碳源，其中葡萄糖对于菌体的生长有最佳的刺激作用，其余依次是甘露糖、纤维素和甘露糖醇。山梨糖和肌醇对于生长的效力最小。在所检测的氮源中，酵母提取物是最有效的，紧接着是麦芽提取物和L-色氨酸，硝酸钠和硫酸铵则是效果最差的。最佳的碳氮比是2:3，最差的碳氮比是5:1。最佳的大量元素是钙离子和镁离子，最佳的微量元素则是铜和锌。
1.简介
Psathyerella atroumbonata(Pegler)是一种可食用真菌，属于担子菌门伞菌目鬼伞科(Alexopolous, Mims & Blackwell, 1996; Makinen, 1977; Zoberi, 1972)。这种真菌在自然界中广泛分布。在热带和亚热带地区的森林落叶、土壤和倒木上都有发现 (Pegler, 1977; Nicholson, 1996)。对于Yoruba人和尼日利亚很多其他部落来说，Psathyerella atroumbonata都是一种极好的食物来源(Makinen, 1977; Oso, 1977a; Alofe, Odu & Illoh, 1998 )。
然而，由于它的担子果不那么引人注目(Zoberi, 1972)，人们常常会忽略它。而在它广泛生长的地方，那些知道它的价值的人则常常为了它起争执。尼日利亚人通常是靠它季节性的出现而食用之，而这并不是很规律的。尽管一些尼日利亚蘑菇的食用和潜在药用价值得到了一定的关注(Oso, 1977b)，但是它们的培养和商业化生产则没有得到足够的重视。所以，本研究旨在提供能够有助于Psathyerella atroumbonata培养技术的实用性强的初步信息。
2.材料与方法
Psathyerella atroumbonata的子实体采集自伊巴丹大学植物园的科特迪瓦榄仁的朽木之上。菌丝体纯培养则是用加入了0.5%酵母提取物的土豆葡聚糖琼脂培养基（PDA）分离纯化的得到的。这种真菌的营养需求是通过菌丝体干重法(Fasidi & Jonathan, 1994)得到的。基础培养基是锥形瓶中1L去离子水中加入各种营养物的产物。培养基中额外添加了50 mg硫酸链霉素以抑制细菌生长，pH值调节到6.5。将基础培养基分装入250立方厘米的容器中，并用铝箔封口，121摄氏度下灭菌15分钟，并确保每种处理都有三个生物重复。每个瓶内接种0.7厘米直径的Psathyerella atroumbonata。
在30±2摄氏度下连续培养7天之后，菌丝体成熟，55摄氏度下烘干18小时并最终称重。
2.1. 碳源单因子实验
所使用的液体培养基含有酵母提取物2.5g，磷酸二氢钾0.05g，七水合硫酸镁0.05g，硫酸亚铁0.01g，硝酸钾1.55g及一升去离子水。液体培养基中含有1%不同种类的碳源，复杂碳源每一升加入十克。对照组选用没有加入任何碳源的培养基(Kadiri & Fasidi, 1994; Chandra & Pur -kayastha, 1977)。
2.2. 氮源单因子实验
基础培养基含有磷酸二氢钾0.05g，七水合硫酸镁0.05g，葡萄糖10g，盐酸硫胺0.5mg及一升去离子水。各种复杂氮源（蛋白胨，尿素，酵母提取物，麦芽提取物和酪蛋白水解物）分别以每升两克的比例加入到基础培养基中。对照组选用没有加入任何氮源的培养基。
2.3. 碳氮比单因子实验
基础培养基与氮源单因子实验中的相同，但不含葡萄糖。取用之前两个实验中最佳的碳源和氮源，即葡萄糖和酵母提取物，各0.1克进入基础培养基中，打造1:1的碳氮比(Fasidi & Olorunmaiye, 1994)。
2.4. 大量元素单因子实验
基础培养基含有葡萄糖10g，硝酸钠2g，七水合硫酸镁0.2g，氯化钙0.3g，盐酸硫胺0.5mg及一升去离子水。每种被测试的大量元素都用其共轭铵替代（例如硝酸钠用硝酸铵替代，硫酸镁用硫酸铵替代）。本实验使用了两种对照，一组含有所有大量元素，一组不含有任何大量元素。
2.5. 痕量元素单因子实验
五种痕量元素（铜，铁，锰，钴和锌）的硫酸盐被分别加入到基础培养基中，浓度均为10毫克每升。本实验使用了两种对照，一组含有所有痕量元素，一组不含有任何痕量元素。
2.6. 数据分析
所有数据都依据Duncan的多范围检测 进行了差异分析和重要性分析。
3.结果与讨论
碳源的单因子实验结果显示葡萄糖是最佳的碳源（表1）。紧随其后的是甘露糖和纤维素。大型食用真菌对于葡萄糖的利用已经为前人所报道(Fasidi & Olorunmaiye,1994; Fasidi & Jonathan, 1994; Hong, 1978; Chandra &Purkayastha, 1977; Oso, 1977a)。这种对葡萄糖的喜爱可能是因为这种糖更容易通过代谢产生细胞能量(Garraway & Evans, 1984; Jandaik & Kapoor, 1976)。甘露糖，次佳碳源，是一种葡萄糖的异构体，可以在代谢过程中转变为葡萄糖(Morrison and Boyd, 1992)。Griffin(1994)曾在文章中指出甘露糖和果糖往往是仅次于葡萄糖的最优碳源。肌醇是实验中效果最差的碳源，对于菌种生长没有已知的重要作用；而效果如此之差可能是由于这种菌体没有可以代谢该种糖醇的酶。
在测试的所有氮源中，最佳的氮源是酵母提取物（表2）。紧随其后的是麦芽提取物和L-色氨酸。这一结果与Fasidi and Olorunmaiye (1994)在Pleurotus tuber-regium的实验上和Alberghina (1973)在Neurospora crassa的实验上结果是相近的。这两种组分对于Psathyerella atroumbonata生长的相似促进作用可能源于他们的碳水化合物和蛋白质组分 (Alberghina, 1973; Bolton & Blair, 1982)。
氨基酸基本都会促进这种大型真菌的生长，其中L-色氨酸的效果尤其突出，其次是L-天冬氨酸和DL-苯丙氨酸。Madunagu (1988)在Pleurotus squarrosulus的研究中曾得到类似的结果。除了硝酸钙和硝酸铵分别促进菌丝生长，分别至70mg/cm3和63mg/cm3；其余的无机氮源都没有明显的促进菌丝的生长。硫酸铵和硝酸钠的培养基内菌丝体生长到36.7mg/cm3，这一结果甚至低于对照组。硝酸根离子对于某些担子菌的生长具有抑制作用 (Griffin, 1994)。硫酸根离子是一个大基团，在过膜过程中可能有一定的困难，所以难以支持其生长(Garraway & Evans, 1984)。
本研究中所用的各种碳氮比都有效促进了菌丝的生长（表3）（P=0.01）。最佳碳氮比为2:3，其次为3:4，最差的则是5:1。此结果与Chandra and Purkayastha (1977; for Agaricus campe stris)和Fasidi and Olorunmaiye (1994; for Pleurotus tuber-regium)得到的