常规病理技术质量控制和工作中易出现的问题及解决办.doc

(完整版)常规病理技术质量控制和工作中易出现的问题及解决办
常规病理技术质量控制
——---—-—工作中易出现的问题及解决办法

目前,我国病理技术主要还是以常规HE、特染和免疫组化为主,科学的管理和规范化操作，是解决质量问题的关键。病理技术很多是凭经验工作，由于经验的随意性较大，导致质量的不稳定性。病理技术有很多小窍门，有的是在牺牲制片质量的前提下发明的。每家医院操作方法不同，导致制片质量各不相同.质控是我们的目标，应依照2004年出版的《病理技术规范化操作》手册来规范实验室的各个操作流程，规范化操作是病理制片质量的保证，而量化的管理可以增加病理制片质量的稳定性,就是在操作过程中，对使用试剂种类、pH值、浓度、温度、时间以及操作的手法都有详细的规定，尽可能的减少人为的影响,减少影响制片质量的条件.要想提高制片质量，必须建立质控组织，通过技术交流和行政监督的手段，做好每一步工作。
一、优质的HE玻片具体反映在以下几方面：
1、切片完整、较薄且均匀　所谓切片完整，是指把取材的组织全部切出，而取材时又要注意如皮肤要有表皮和真皮，肠壁和胃壁要有粘膜和肌层,肾脏要有皮质和髓质等。切片不可过厚，一般为3~4μm,过厚就见细胞重叠，有碍镜下观察。如切片有刀痕就不美观,刀痕如在病灶处则影响诊断。更不应出现跳刀，即组织一截厚一截薄.
2、裱贴恰当、无皱摺　裱贴时要求“定点”和“定向”。所谓“定点”，就是要把每张蜡片贴在载玻片正中偏右,裱贴2张蜡片时则在贴标签位置的右侧,给人一种整齐美观的感觉，同时在镜检时又可在较小范围内使用镜台上的移动器，从而节省操作时间.而“定向”是要根据各种不同组织蜡片的方向或表里位置进行倒贴。例如皮肤蜡片应把表皮向下，胃肠道蜡片应把粘膜层朝下（这是因为由于光学显微镜所形成的图像是一个放大倒立虚像的缘故).这样“定向"后,切片上的表皮或粘膜面向下，在镜下观察时所形成的图像是表皮向上和粘膜上皮向上。裱贴时水温要恰当，使蜡片伸展无皱摺。
3、染色鲜艳、对比清晰　一张玻片标本本身是无色的，在镜下无法辨别细胞和组织，更难以观察其微细的形态改变。以HE来说，要通过苏木精把胞核染成蓝色，伊红把胞质染成红色。纤维和肌肉等也染成深浅不同的红色。这样既要染色鲜艳，又要红蓝分明，对比清晰,才利于镜下观察.要染出一张优质的玻片标本，其中与组织是否新鲜、固定是否及时以及脱水包埋过程是否恰当有关,与染色时的质控也密切相关。要熟悉各种染料的基本特性,染色机制，熟练掌握染色液的配制以及染色、分化和流水冲洗等操作步骤，还要注意最后的脱水、透明，即使切片染色很理想，也会因脱水、透明不彻底而影响制片质量.

4、片内无污染、无“龟裂”、封片无气泡、胶不流溢　切片内污染，多由于苏木精染液的氧化物或伊红染液的絮状沉淀所致。这可通过定期过滤各种染色液，染缸要加盖等办法来避免。在染色过程中，要避免切片干涸，否则容易导致染片“龟裂”，特别是某些组织如脾脏和淋巴结较常出现。在封片前如让染片干涸，或染色后放在高温恒温箱烤干，就更容易形成“龟裂”.封片有气泡，多因树胶过浓，或因玻棒搅动树胶而引起。因此染色前要调好树胶的浓度，以提起玻棒时树胶如珠滴状慢慢滴下为宜.封片时所滴的树胶要适量，盖片后树胶不过度外溢为宜。如遇潮湿天气封片,应在防潮罩内进行.
5、玻片整洁,标签端正,号码清楚 解决这些小问题后，使切片整洁美观，给人一种美的感受。
二、组织在固定包埋中要注意的事项
1、固定应及时　应采用4%~8％甲醛液固定组织。组织固定是制片的关键。固定的好坏,决定了以后制片的各个环节.因此,组织离体后要尽快固定，固定时间因组织的大小而异。巨大组织要切成小块固定，小块组织的固定时间从数小时至1天，然后修切成大小约22mm×22 mm，厚不超过2 mm的组织块进行脱水。
2、脱水要彻底　脱水液常用乙醇,要由低浓度逐级至高浓度，逐步置换组织内的水分。组织在乙醇脱水时，低浓度乙醇的时间可适当延长，至无水乙醇时则要掌握恰当时间，如脱水时间过短则脱水不足,影响了下一步的透明;如脱水时间过长，则导致组织收缩变硬，难以切出理想切片。比如说我们更换脱水试剂，一般都是要等组织不好切了才换，这样总有几天片子质量不好；也有的是几天到了就换，组织多时脱水液的水份就多，后面几天可能组织就脱不好；组织少了脱水液倒了很浪，用量来控制脱水的更换时间更具科学性。
3、透明宜充分　透明液多采用二甲苯，组织脱水后转入二甲苯,依据组织的大小、厚薄，约置30～90min，组织就呈透明状，表明组织内已完全无水，这时就可把组织转入熔溶的石蜡内进行浸蜡.如果组织在二甲苯内仍呈混浊状，说明组织仍有水分，这时如投入石蜡内，包埋就会影响切片。如果组织在二甲苯透明时间过长，就引起组织变脆，较难切出完整切片。
4、浸蜡需足够　浸蜡多用纯净而熔点稍低的石蜡，浸蜡时采用三级，尽量清除二甲苯。开始一级用熔点较低石蜡，最后一级用熔点较高的石蜡或包埋石蜡。浸蜡时间依据组织大小厚薄而定，一般为1～3　h。浸蜡时恒温箱的温度应比所用石蜡熔点稍高以保持石蜡恰在熔溶状态。这样,组织才能取得良好的浸蜡效果。但要注意在浸蜡时恒温箱的温度要恒定。如温度过高，导致组织收缩，变硬变脆,难以切出理想切片。
5、包埋应恰当　包埋时，包埋石蜡的温度要比组织高（4℃～6℃），否则包埋冷凝后组织与包埋石蜡分离,特别是在冷天包埋时,动作更要迅速,不要把组织翻来翻去，这样易导致组织与石蜡融合不好，而影响切片。包埋时把组织最大最平切面或所需的病灶切面向下,对皮肤、肠管和囊壁等层次清楚的组织其切面应包含有各层组织。

6、切片要薄　切片首要任务是把切片刀研磨锋利，这是能否切出薄而平整切片的关键。其次要把刀架上的切片清除角调至2°~5°，在此角范围内,才能切出良好蜡片。如使用一次性刀片，可转动刀座上的弧形刻度盘选取最合适的刻度（该合适刻度并不等于是真正的切片清除角)。切片前要把切片机上有关的各螺旋拧紧，如没有拧紧或包埋的组织蜡块过硬时就会出现跳刀，使蜡片成一截厚一截薄。切片的厚度应为3～4μm。

7、贴片、烤片有讲究　切出的蜡片应放在恒温贴片盆内展开，并根据所用包埋石蜡的温度调节水温42℃～46℃。为了利于展平蜡片，可先把蜡片放在一缸约15%乙醇内，然后用载玻片再将蜡片移置至恒温贴片盆，由于水的表面张力比乙醇大,蜡片由乙醇移至水后易展平。贴片时再注意“定点”和“定向”。最后即可置入60℃～65℃的烤箱内烤30~60min，也可放在热板上烘干，这样蜡片就可牢固地粘附于载玻片或盖玻片上.
三、　HE染色中要注意的事项
1、切片脱蜡需干净　未完全脱蜡的组织切片,染色后组织和细胞模糊不清，形成地图形。脱蜡要用两级脱蜡剂如二甲苯，时间为10～20min,应视所用二甲苯的新旧以及室温情况而定.脱蜡时间宁可长些，不应过短，其间应把染色抽提高、放下2～3次可加速脱蜡。
2、苏木精染液要配好　苏木精液配制的好坏，决定染色的优劣.苏木精配制有多种配方，关键在氧化剂.如加氧化汞作氧化剂时，要把苏木精液煮沸后0.5~1min后加上，随即置冰水中冷冻以防止氧化过度。加碘酸钠作氧化剂时，就无需把苏木精液煮沸。要配制自然成熟的苏木精液则不需加氧化剂，而用多层纱布封口，让苏木精液经常接触阳光，这样数月后才能氧化成熟。如用氧化汞作氧化剂的苏木精液，在染色过程中很易在液面形成一层氧化膜,在每次染色之前应该过滤或用纸把液面的氧化膜拖走，以免污染切片。不同苏木精染液的染色时间为5～20min,自然氧化成熟的苏木精液染色时间可以更长.
3、盐酸乙醇的分化要适度　这是一个重要环节。若切片不分化或分化不足，组织着色过深使核浆的境界不清楚；若分化过度,胞核过淡不清晰。至于分化时间的长短,一般为1～2s，但具体时间要视组织的性质，切片的厚薄，苏木精染色的深浅来决定。若用Mayer苏木精液，通常都不用分化。盐酸乙醇分化后,切片留有酸液，易使切片褪色.另一方面苏木精经酸后也要经流水冲洗来促蓝,使苏木精色淀又重新形成.流水冲洗一般需15~30min.如急于诊断时，也可用碱性的促蓝液来代替流水冲洗。
4、伊红染色要适宜　伊红是作为对比染色,染色时不应染得太红，以免“喧宾夺主”.也不能染得太淡,否则红蓝对比不鲜明。每200ml伊红水溶液加一滴冰醋酸可起促染作用,如加酸太多，可使伊红沉淀而慢慢失效。伊红水溶液易发霉，每缸伊红液加入甲醛液1~2滴有防霉作用。
5、切片脱水、透明要彻底　HE染色后，要彻底脱水透明，才能进行树胶封盖,成为永久标本。如果脱水不彻底，封片后呈白色雾状，镜下模糊不清，过一段时间染片即褪色。脱水要经过多次无水乙醇，也可使用石碳酸二甲苯进行脱水.如采用后者，染片要经过多次二甲苯以除去石碳酸。
6、封胶要求中性，浓度要适宜　酸性的树胶可使胞核褪色，如树胶放置时间过长，因氧化而变酸.树胶过浓，封片时容易导致气泡,树胶过稀，封片时使胶外溢，影响美观。
7、染色过程不让切片干涸　切片完全干涸，会使组织收缩、割裂,形成所谓“龟裂”现象.其次，经干涸的组织，会使部分细胞核透明不良，胞核不为光线透过,像黑色的核。

四、HE玻片的质量评价
在80年代对广州市各医院病理科连续3年医检标本制片质量抽查（每科室抽查5例，统一为子宫肌瘤、乳腺、甲状腺、阑尾和穿刺小组织)。广东省病理技术学组对每张HE玻片从以下8个方面去评价，并根据每一个技术项目的重要性来评分(仅供大家参考)。
① 切片完整、贴片恰当10分
② 切片较薄和均匀20分
③ 无皱折10分
④ 无刀痕10分
⑤ 染色清晰、核浆分明、透明度好30分
⑥ 无固缩、龟裂、污染10分
⑦ 封胶适当、玻片清洁5分
⑧ 字体端正、号码清楚5分
在给分过程中，要根据上述8个方面的质量严格给分，每项分数达到90%以上就算是一张优质的HE玻片标本。
　　1张优质的玻片标本，既给我们一种美的感觉和享受,更重要的是有利于病理医师的镜下观察和诊断.如果制片不好，就无法确诊甚至于误诊。1张玻片标本的好坏，反映了病理技术人员的技术水平，当然所使用的仪器和染料的质量、临床的配合对其也有一定影响.

五、石蜡切片中易出现的问题及解决方略
1、切片脱落和部分脱落原因：组织中富含血液成分，如脾、肺、肝、宫内膜组织、异位妊娠破裂组织、凝血等；组织中富含脂肪成分，如脂肪组织、畸胎瘤、皮脂腺囊肿等;组织中富含胶质成分，如甲状腺组织等。
2、组织较硬，如干涸、坏死或骨组织等均易脱片而导致无法诊断.
3、组织取材太大太厚,组织脱水透明不彻底，组织与石蜡不能很好的结合，切片时组织中间有“白心”,不能切出薄而平的切片,勉强切出的切片厚且经脱蜡、脱水、染色等步骤后容易脱片。
4、脱水过程中无水乙醇和二甲苯时间过长。
5、浸蜡的温度太低,石蜡不能完全溶解而影响石蜡的浸入；浸蜡时间过长、温度过高或石蜡长时间未更换，二甲苯含量增加等因素引起组织收缩过大、变脆变硬,易引起脱片。
6、切片刀钝时，切片厚;切片刀有缺口时，易造成切片断裂破碎和不完整。
7、展片水温低、切片褶皱未能充分伸展等原因造成与载玻片附贴不牢，或附贴时切片下气泡过多,切片石蜡未完全干燥就烘片均易造成组织脱落。
8、烤片温度过低、烤片时间过短。
9、载玻片不清洁。
10、水洗时水流速度过快或水直接冲洗在切片上以及振荡剧烈.
11、盐酸酒精或氨水浓度过大或停留时间较久等引起组织脱落。处理方法：
1、捞取含血成分多、脂肪多、胶质多的组织、骨组织以及较厚的切片时，可先在干净的载玻片上涂少许蛋白甘油再贴片。
2、取材不能太大太厚.
3、脱水机内的脱水、透明液必须保持一定浓度。脱水机液体的更换视标本量的大小而定。
4、在切片时应及时更换锋利的切片刀。
5、展片温度要适宜，一般要低于石蜡熔点4~8℃。贴片时可在展片水浴中加适量乙醇，有助于组织展开,减少褶皱产生.
6、烤片温度一般要高于石蜡熔点的15～20℃，时间30~60 min.
7、染色时水流不能过急过大，要轻微振荡，不能过于剧烈。切片不能直接放于水流下冲洗。
8、脱石蜡的各级乙醇以及脱水的各级乙醇浓度要梯度递减或递增。
9、染液及分化液酸碱度要适宜。