培养基成分与配制.ppt

l 实质上，上，对于整株植物生于整株植物生长有重要作用的有重要作用的这1515种元素，种元素，对于于组织培养来培养来说也是必需的。各种常用也是必需的。各种常用培养基之培养基之间在在组分上的主要差分上的主要差别，即在于各种，即在于各种盐或或离子数量上的不同。由离子数量上的不同。由质上来看，各种植物上来看，各种植物组织所所需要的无机需要的无机营养是相当一致的。养是相当一致的。l 当无机当无机盐在水中溶解的在水中溶解的时候，它候，它们发生解离，生解离，形成离子。培养基中的活性因子即是形成离子。培养基中的活性因子即是这些离子，而些离子，而不是它不是它们的化合物。一种的化合物。一种类型的离子可由一种以上型的离子可由一种以上的的盐提供。提供。l 1.l WhiteWhite培养基是最早的植物培养基是最早的植物组织培养基之一，其中包培养基之一，其中包含了所有必需的含了所有必需的营养成分，被广泛用于根的培养。不养成分，被广泛用于根的培养。不过，很多研究者的很多研究者的经验表明，要想使愈表明，要想使愈伤组织能令人能令人满意地生意地生长，这个培养基中的无机成分在数量上是不足的。早期采个培养基中的无机成分在数量上是不足的。早期采用的克服用的克服这种缺陷的种缺陷的办法是在培养基中加入某些复法是在培养基中加入某些复杂的混的混合物，如酵母浸出物、水解酪蛋白、椰子汁和氨基酸等。合物，如酵母浸出物、水解酪蛋白、椰子汁和氨基酸等。为了改了改进合成培养基，后来的研究者通合成培养基，后来的研究者通过增加各种无机增加各种无机盐的的浓度，特度，特别是是钾和氮的和氮的浓度，成功地取代了那些复度，成功地取代了那些复杂的的混合物。和混合物。和WhiteWhite培养基比培养基比较，在，在现在广泛在广泛应用的各种培用的各种培养基中，多数都含有养基中，多数都含有浓度度较高的无机高的无机盐。HellerHeller（19531953）在其培养基中加入了在其培养基中加入了铝和和镍，但，但这两种元素的必要性并未两种元素的必要性并未得到得到证明，因此已被后来的研究者所省略。明，因此已被后来的研究者所省略。钠、氯化物和化物和碘化物的必要性迄今也碘化物的必要性迄今也还没有得到没有得到证明。明。2.l 在在WhiteWhite（19431943）原来的培养基中，）原来的培养基中，铁是以是以FeFe(SO(SO)的的形式加入的，但形式加入的，但StreetStreet及其合作者在根培养中以及其合作者在根培养中以FeCIFeCI代替了代替了FeFe(SO(SO)，这是因是因为在在FeFe(SO(SO)中含有中含有MnMn和某些其他金和某些其他金属离子属离子杂质。然而，。然而，FeCIFeCI看来也并不是一个完全令人看来也并不是一个完全令人满意意的的铁盐。以。以这种形式存在的种形式存在的铁只有在只有在PH5.2PH5.2左右左右时才能被才能被组织所利用。已知在根培养中，接种后一周之内培养基的所利用。已知在根培养中，接种后一周之内培养基的PHPH值即会由原来的即会由原来的4.94.95.05.0上升到上升到58586.06.0，于是根开始表，于是根开始表现缺缺铁症状。症状。为了解决了解决这个个问题，现在在多数培养基中在在多数培养基中铁是以一是以一种螫合形式，即种螫合形式，即 Fe EDTAFe EDTA（EDTAEDTA乙二胺四乙酸）的形式提供乙二胺四乙酸）的形式提供的。以的。以这种形式提供的种形式提供的铁直到直到PH7.6PH7.68.08.0仍然可以被植物仍然可以被植物组织所利用。附所利用。附带说一下，与根不同，愈一下，与根不同，愈伤组织培养物直到培养物直到PHPH为6.06.0时仍可利用仍可利用FeCIFeCI ，这是因是因为愈愈伤组织能分泌自然的能分泌自然的鳌合合剂，而螫合，而螫合剂可与可与铁相相结合。合。Fe EDTAFe EDTA可使用可使用FeSOFeSO7H7H2 2O O对和和NaNa2 2EDTAEDTA进行制行制备，或者，如果可能的，或者，如果可能的话，从市，从市场上直接上直接购买NaFeEDTANaFeEDTA。l 3.l 在培养基中无机氮的供在培养基中无机氮的供应可以有两种形式，可以有两种形式，一种是硝酸一种是硝酸盐；另一种是；另一种是铵盐。当做。当做为唯一的唯一的氮源氮源时，硝酸，硝酸盐的作用要比的作用要比铵盐好得多，但在好得多，但在单独使用硝酸独使用硝酸盐时，培养基的，培养基的PHPH会向碱性方向会向碱性方向漂移。若与硝酸漂移。若与硝酸盐一起加入少量一起加入少量铵盐，则会阻会阻止止这种漂移。因此，有好几种培养基都既含有种漂移。因此，有好几种培养基都既含有硝酸硝酸盐，也含有，也含有铵盐。l 4.l 当某些当某些营养元素的供养元素的供应不足不足时，愈，愈伤组织所表所表现出来的症状如下：出来的症状如下：l 氮氮某些某些组织（五叶地（五叶地锦）表）表现出一种很引出一种很引人注目的花色素苷的人注目的花色素苷的颜色；不能形成色；不能形成导管；管；l 氮、氮、钾或磷或磷细胞胞过度生度生长，形成，形成层组织减减退；退；l 硫硫非常明非常明显地褪地褪绿；l 铁细胞分裂停止；胞分裂停止；l 硼硼细胞分裂停滞，胞分裂停滞，细胞伸胞伸长；l 锰或或钼影响影响细胞伸胞伸长。5.l2.2.有机有机营养成分养成分l(1)(1)含氮物含氮物质l 大多数培养的大多数培养的细胞都能合成所有必需的胞都能合成所有必需的维生素，生素，只是数量上只是数量上显然不足。然不足。为了能使了能使组织很好地生很好地生长，在，在培养基中常常必培养基中常常必须补加一种或一种以上的加一种或一种以上的维生素和氨生素和氨基酸。其中硫胺素（基酸。其中硫胺素（维生素生素B B）一般）一般认为是一种必是一种必需的成分。在其他各种需的成分。在其他各种维生素中，已知尤其是吡哆醇生素中，已知尤其是吡哆醇（维生素生素B6B6），烟酸（），烟酸（维生素生素B B），泛酸），泛酸钙（维生生素素B B）和肌醇也都能改善培养的植物）和肌醇也都能改善培养的植物组织的生的生长状状况。各种况。各种维生素皆溶于水，唯叶酸例外，先要用少量生素皆溶于水，唯叶酸例外，先要用少量稀氨水溶解，然后加蒸稀氨水溶解，然后加蒸馏水定容水定容。l 6.l 为了促了促进某些愈某些愈伤组织和器官的生和器官的生长，还常使用很多种化学成分不明的复常使用很多种化学成分不明的复杂的的营养混合养混合物，如物，如水解酪蛋白（水解酪蛋白（CHCH），椰子汁（），椰子汁（CMCM），），玉米胚乳，麦芽浸出物（玉米胚乳，麦芽浸出物（MEME），番茄汁），番茄汁（TJTJ）和酵母浸出物（）和酵母浸出物（YEYE）等。不等。不过，只要，只要可能，可能，应尽量避免使用尽量避免使用这些天然物些天然物质。这些物些物质（特（特别是果是果实提取物）在提取物）在样品品间的差异将会的差异将会影响影响实验结果的可重复性。果的可重复性。这是因是因为，这类提提取物所含的生取物所含的生长促促进成分的成分的质和量常因和量常因组织的的年年龄和供体植株的品种而和供体植株的品种而变化。此外，只用一化。此外，只用一种氨基酸也可能有效地取代种氨基酸也可能有效地取代这些天然物些天然物质。7.l(2)(2)碳源碳源l Haberlandt（1902）曾试图培养绿色的叶肉细胞，这可能是出自绿色细胞对营养的要求比较简单的想法，但这种想法在实验中并未得到证实。现在我们知道，作为一个规律，起初是绿色的组织在培养中会逐渐失去它们的叶绿素，而只依赖于外界碳源生活。即使是那些在培养期间由于某些突然变化或被置于特殊条件之下而获得了色素的组织，也不是碳素自养的。如果在培养基中加入一种合适的碳源，就是在培养中已经充分分化了的绿色幼茎也会生长得更好。由此看来，在培养基中加入一种可被利用的碳源是十分必要的。l 8.l 最常用的碳源是蔗糖，最常用的碳源是蔗糖，浓度一般度一般为2 25 5。已知葡。已知葡萄糖和果糖也能使某些萄糖和果糖也能使某些组织生生长得很好，得很好，BallBall（19531953，19551955）证实，对于于红杉属植物（杉属植物（SequoiaSequoia）愈）愈伤组织的生的生长来来说，经过高高压灭菌的蔗糖菌的蔗糖优于于过滤灭菌的蔗糖，看来高菌的蔗糖，看来高压灭菌能使蔗糖水解成菌能使蔗糖水解成为更能被有效利用的糖，如果糖。更能被有效利用的糖，如果糖。l 一般来一般来说，以蔗糖做碳源，以蔗糖做碳源时，离体的双子叶植物的根，离体的双子叶植物的根生生长得最好。而以右旋糖（葡萄糖）做碳源得最好。而以右旋糖（葡萄糖）做碳源时，单子叶植子叶植物的根生物的根生长得最好。矮生苹果（得最好。矮生苹果（Mains pumilaMains pumila，品种，品种MclntoshMclntosh）的）的组织培养物在以山梨醇做碳源和以蔗糖或葡培养物在以山梨醇做碳源和以蔗糖或葡萄糖做碳源萄糖做碳源时都都长得很好。得很好。l 已知植物能已知植物能够利用的某些其他形式的碳源有麦芽糖、利用的某些其他形式的碳源有麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖。半乳糖、甘露糖和乳糖。红杉属植物和玉米胚乳的杉属植物和玉米胚乳的组织培培养物甚至可以代养物甚至可以代谢作作为唯一碳源的淀粉。唯一碳源的淀粉。9.l3.3.植物生植物生长物物质l 除了除了营养物养物质以外，以外，为了促了促进组织和器和器官的生官的生长，通常，通常还有必要在培养基中加入一有必要在培养基中加入一种或一种以上的生种或一种以上的生长调节物物质。如生。如生长素、素、细胞分裂素或赤霉素。胞分裂素或赤霉素。10.l(1)(1)生生长素素l 在自然界中，生在自然界中，生长素影响到茎和素影响到茎和节间的伸的伸长、向性、向性、顶端端优势、叶片脱落和生根等、叶片脱落和生根等现象。在象。在组织培养中，生培养中，生长素被用于素被用于诱导细胞的分裂和根的胞的分裂和根的分化。在分化。在组织培养中常用的生培养中常用的生长素有：素有：IAAIAA、IBAIBA、NAA.NAA.、NOANOA（萘氧乙酸）、氧乙酸）、P PCPACPA（对氯苯氧乙酸）苯氧乙酸）、2,4-D2,4-D（二（二氯苯氧乙酸）和苯氧乙酸）和2,4,52,4,5T T（三（三氯苯氧苯氧乙酸）。其中乙酸）。其中IBAIBA和和NAANAA广泛用于生根，并能与广泛用于生根，并能与细胞分裂素互作促胞分裂素互作促进茎的增殖。茎的增殖。2,4-D2,4-D和和2,42,4，5 5T T对于愈于愈伤组织的的诱导和生和生长非常有效。生非常有效。生长素一素一般溶于般溶于9595酒精或酒精或0.lmol0.lmolL L的的aOHaOH中，以后中，以后者的溶解效果更好。者的溶解效果更好。11.l生长素活性:2,4-DNAAIAA 2,4-D 的活性经IAA高8-12倍,2,4-D在植物体内比较稳定,而IAA极不稳定。12.l(2)(2)细胞分裂素胞分裂素l 细胞分裂素影响胞分裂素影响细胞分裂、胞分裂、顶端端优势的的变化和茎的分化等。在培养基中加入化和茎的分化等。在培养基中加入细胞分裂素胞分裂素的目的，主要是的目的，主要是为促促进细胞分裂和由愈胞分裂和由愈伤组织或器官上分化不定芽。由于或器官上分化不定芽。由于这类化合物有助于化合物有助于使腋芽由使腋芽由顶端端优势的抑制下解放出来，因此也的抑制下解放出来，因此也可用于茎的增殖。比可用于茎的增殖。比较常用的常用的细胞分裂素有：胞分裂素有：BAPBAP（苄氨基瞟呤），氨基瞟呤），6 6BABA（苄基腺瞟呤），基腺瞟呤），2 2iPiP（异戊（异戊烯氨基膘呤）和氨基膘呤）和(KT)(KT)激激动素（素（呋喃氨喃氨基基嘌呤）。呤）。细胞分裂素一般溶于胞分裂素一般溶于0.50.5或或lmollmolL L的的HCIHCI或稀的或稀的NaOHNaOH中。中。13.l细胞分裂素的活性：ZTBAKT腺嘌呤.ZT的活性比KT高10倍,KT的活性比腺嘌呤3万倍.14.(3)(3)赤霉素赤霉素 赤霉素有赤霉素有2020多种，其中在多种，其中在组织培养中所培养中所用的是用的是GAGA。与生。与生长素和素和细胞分裂素相比，胞分裂素相比，赤霉素不常使用。据赤霉素不常使用。据报道，赤霉素能刺激在道，赤霉素能刺激在培养中形成的不定胚正常培养中形成的不定胚正常发育成小植株。赤育成小植株。赤霉素易溶于冷水，每升水最多可溶解霉素易溶于冷水，每升水最多可溶解1 1mgmg。GAGA溶于水后不溶于水后不稳定，容易分解，故最定，容易分解，故最好以好以9595酒精配成母液在冰箱中保存。酒精配成母液在冰箱中保存。l 15.l4.4.琼脂脂l 如果使用液体培养基如果使用液体培养基进行静止培养，行静止培养，组织将会沉没并将会沉没并因缺氧而死亡。因缺氧而死亡。为了避免了避免这种情况，可用种情况，可用琼脂使培养基凝脂使培养基凝胶化，然后把胶化，然后把组织置于培养基表面。置于培养基表面。琼脂是一种由海藻得脂是一种由海藻得来的多糖来的多糖类物物质，一般的使用，一般的使用浓度是度是0.70.71 1，若，若浓度度太高，培养基就会太高，培养基就会变得很硬，得很硬，营养物养物质就就难于于扩散到培养散到培养的的组织中去。由于在中去。由于在这种半固体培养基上所建立的培养物种半固体培养基上所建立的培养物便于保存，而且便于保存，而且对于多种目的的于多种目的的实验来来说都能得到令人都能得到令人满意的意的结果，因此果，因此琼脂固化培养基得到了广泛的脂固化培养基得到了广泛的应用。但用。但琼脂并非是培养基中的一种必需成分。脂并非是培养基中的一种必需成分。l 单细胞和胞和细胞聚合体可以在含有无机和有机胞聚合体可以在含有无机和有机营养以及养以及激素的液体培养基中激素的液体培养基中进行行悬浮培养。不浮培养。不过，在，在悬浮培养中浮培养中必必须定定时通气，其方法或是由培养基底部鼓入无菌空气，通气，其方法或是由培养基底部鼓入无菌空气，或是不断或是不断轻轻摇动。在原生。在原生质体培养中，如果采用浅体培养中，如果采用浅层液液体培养基或小滴液体培养基体培养基或小滴液体培养基进行培养，行培养，则可保持静止，不可保持静止，不必通气。必通气。16.5.5.P H P H 值 在灭菌之前PH值一般都是调节到5.0-6.0之间，一般来说，当PH值高于6时，培养基会变硬，低于5时，琼脂不能很好地凝固。6.6.其他成分其他成分 （1）活性炭：在培养基中加入活性炭（AC）主主要是为了吸附植物的有害分泌物，但活性炭对物质吸附的选择性很低，它同时也吸附某些植物必需的化合物。活性炭的用量一般为0.5%-3%。注意：在高压灭菌之前加入活性会降低培养基的PH值，合使培养基不易凝固。17.（2）硝酸银：离体培养的植物组织会产生和散发乙烯，而乙烯在培养容器中和积累会影响培养物的生长和分化，AgNO3中的Ag+通过竞争性地结合于细胞膜上的乙烯受体蛋白，从而可起到抑制乙烯活性的作用。培养基中加AgNO3能促进愈伤组织器官发生或体细胞胚胎发生，并能使某些原来再生困难的物种分化出再生植株。AgNO3对于克服试管苗玻璃化及早衰和落叶等也有明显效果。由于低浓度AgNO3能引起细胞坏死，而这种坏死、细胞会产生一定数量的乙烯，所以AgNO3不一定总能阻止乙烯的积累。AgNO3的使用浓度一般为110mg/l。使用过滤灭菌。18.（3）抗生素：培养基中添加抗生素的主要目的，是防止由外植体内生菌造成的污染。注意：不同抗生素抑制不同菌种，因此要有针对性选择抗生素；有时必须几种抗生素结合使用才能取得较好的效果；抗生素的使用对植物的生长有一定的抑制作用；在停用抗生素后，污染率往往显著上升。常用的抗生素有青霉素、链霉素、土霉素等，用量一般为520mg/L。大部分要求过滤灭菌。19.l二、培养基的种二、培养基的种类l 长期以来期以来,根据根据组织培养的不同目的和培养的不同目的和选用的不同材料用的不同材料,科学工作者科学工作者们设计了了许多不同多不同种种类的培养培养基基，最常的培养培养基基，最常见的培养基的培养基为MSMS培培养基（养基（见表表3-13-1）。）。lMS培养基：培养基：Murashige和和Skoog于于1962年年为烟草烟草细胞培胞培养养设计的，其特点是无机的，其特点是无机盐和离子和离子浓度度较高，是高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数含量高，其养分的数量和比例合适，能量和比例合适，能满足植物足植物细胞的胞的营养和生理需要养和生理需要,因因而适用范而适用范围比比较广，多数植物广，多数植物组织培养快速繁殖用它培养快速繁殖用它作作为培养基的基本培养基。培养基的基本培养基。20.l 表表3-1 MS3-1 MS培养基培养基 l 大量元素大量元素 (mg/L)微量元素微量元素 (mg/L)l（NH4NO3）.1650 KI.0.83l（KNO3）.1900 H3BO3.6.2l（CaCI22H2O）.440 MnSO4 4H2O 22.3l（MgSO47H2O）.370 ZnSO4 7H2O 8.6l（KH2PO4）.170 Na2MoO4 2H2O .0.25l维生素生素 CuSO4 5H2O.0.025l肌醇肌醇.100 CoCl2 6H2O.0.025l烟酸烟酸.0.5 FeSO4 7H2O .27.8l盐酸硫酸硫铵素素.0.1 Na EDTA.37.3l盐酸吡哆素酸吡哆素 0.5 生生长调节物物质l有机附加物有机附加物 KIN.0.0410l甘氨酸甘氨酸.2.0 2，4-D.1-30l蔗糖蔗糖.30g/L pH 5.721.l 植物组织培养能否取得成功,营养培养基的种类是一个很关键的问题。比较常用的培养基及其成分见表3-2。22.l表表3-2 3-2 常用的培养基及其成分常用的培养基及其成分23.24.表表表表3-3 3-3 3-3 3-3 不同培养基离子不同培养基离子不同培养基离子不同培养基离子浓浓度的比度的比度的比度的比较较25.l三、培养基的三、培养基的选择l1.1.培养基培养基选择的原的原则l(1)(1)目的性目的性强：要要针对不同的培养目的如初不同的培养目的如初代培养、增殖培养、生根培养，分代培养、增殖培养、生根培养，分别选择最适合最适合的培养基的培养基;l(2)(2)成本低廉：成本低廉：要考要考虑到工厂化生到工厂化生产时的运的运营成本，以成本，以总体运体运营效益来效益来评价一种培养基的价一种培养基的优劣。劣。l(3)(3)方便可行：方便可行：试剂容易容易选购，培养基的制，培养基的制备操作操作简单易行。易行。26.l2.2.培养基培养基筛选的方法的方法l (1)(1)选择基本培养基基本培养基:l 在建立一个新的在建立一个新的实验体系体系时，为了能研制了能研制出一种适合的培养基，一般最好先由一种已被出一种适合的培养基，一般最好先由一种已被广泛采用的基本培养基（如广泛采用的基本培养基（如MSMS或或B B）开始。）开始。27.l(2)(2)选择最佳激素最佳激素组合合:l 在植物在植物组织培养基中最常改培养基中最常改动的因子是生的因子是生长调节物物质，尤其是生，尤其是生长素和素和细胞分裂素。胞分裂素。l 开始开始时，可以，可以选择一种基本培养基，以及不同一种基本培养基，以及不同激素激素组合，比如合，比如说，各有，各有5 5种不同种不同浓度（度（0 0，0.50.5，2.52.5，5 5，10mol10molL L）的某种生）的某种生长素（例如素（例如NAANAA）和某种和某种细胞分裂素（例如胞分裂素（例如BAPBAP）。）。这两种激素两种激素5 5种种浓度的所有可能度的所有可能组合，即构成了一个具有合，即构成了一个具有2525项处理的理的实验（表（表3 34 4）。由）。由这2525项处理中理中选出最好的一个，出最好的一个，然后在保持然后在保持浓度不度不变的情况下，再的情况下，再试验其他种其他种类的的生生长素和素和细胞分裂素。胞分裂素。l 注意注意:当改当改变细胞分裂素的种胞分裂素的种类时，保持生，保持生长素不素不变，反之亦然。，反之亦然。28.表表表表3-4 3-4 3-4 3-4 二种激素五种二种激素五种二种激素五种二种激素五种浓浓度的各种度的各种度的各种度的各种组组合合合合29.l(3)(3)选择适宜的适宜的盐分分浓度度:l 高浓度盐分培养基对若干实验体系来说都已证明效果很好，但有某些培养物在低浓度盐分培养基上生长得更好，因此就还有必要试验一下在保持生长调节物质最佳组合不变的情况下，1 12 2和和1 14 4水平的基本培养基盐分的效果。30.l(4)(4)确定适宜的蔗糖确定适宜的蔗糖浓度度:l 在保持其他成分不在保持其他成分不变的情况下，的情况下，设计一个蔗糖一个蔗糖浓度梯度（度梯度（2 26 6以至更以至更高），一高），一筛选出最适宜的蔗糖出最适宜的蔗糖浓度。度。l 通通过以上以上这些些实验，常常就足以研，常常就足以研制出一种适合的培养基。不制出一种适合的培养基。不过，为了了对这种培养基做种培养基做进一步的改良一步的改良还有很多其有很多其他可能性他可能性值得探得探讨。31.l(5)(5)广广谱实验法法:l 为了能了能给一个新的一个新的实验体系体系选出一种适合的培养基，出一种适合的培养基，De De Fos-sardFos-sard等（等（19741974）介）介绍了一种了一种“广广谱实验法法”。和上面。和上面介介绍的方法相比，的方法相比，这个方法是比个方法是比较复复杂的。然而，如果利用的。然而，如果利用简单的方法解决不了的方法解决不了问题，就有必要用，就有必要用这个方法个方法试验一下。一下。l 1)1)在在这个广个广谱实验法中，把培养基中的所有法中，把培养基中的所有组分分分分为4 4大大类：无机：无机盐、生、生长素、素、细胞分裂素、有机胞分裂素、有机营养物养物质（蔗糖、（蔗糖、氨基酸和肌醇等）。氨基酸和肌醇等）。l 2)2)对每一每一类物物质再再选定定3 3个个浓度，即低（度，即低（L L），中），中（M M）和高（）和高（H H）（）（见表表3-43-4）。）。4 4类物物质各各3 3种种浓度的各种不度的各种不同同组合即构成了一合即构成了一项包括包括8181个个处理的理的实验。l 3)3)在在这8181个个处理中最好的一个可用个字母表示。例理中最好的一个可用个字母表示。例如，一个包含中等如，一个包含中等浓度无机度无机盐、低、低浓度生度生长素、中等素、中等浓度度细胞分裂素和高胞分裂素和高浓度有机度有机营养物养物质的的处理即可表示理即可表示为MLMHMLMH。顺序是无机序是无机盐-生生长素素-细胞分裂素胞分裂素-有机有机营养。养。l 4)4)达到达到这个个阶段以后，即可再段以后，即可再试验不同不同类型的生型的生长素素和和细胞分裂素，以找到它胞分裂素，以找到它们的最好的最好类型。型。32.表表3-5 3-5 广广谱实验法中，各法中，各类物物质的成分和的成分和浓度度33.l四、培养基的制四、培养基的制备l 1.1.干粉直接配制干粉直接配制:l 现在配制培养基的最在配制培养基的最简单的方法是用市售培养的方法是用市售培养基干粉，其中含有无机基干粉，其中含有无机盐、维生素和氨基酸。把生素和氨基酸。把这种干粉溶解在蒸种干粉溶解在蒸馏水里（要比培养基的最水里（要比培养基的最终容容积少少1010），加上蔗糖、），加上蔗糖、琼脂和其他必要的脂和其他必要的补加物，最加物，最后再加入蒸后再加入蒸馏水使之达到最水使之达到最终的容的容积。调节PHPH，高，高压灭菌，于是制成所需要的培养基。在有些国家有菌，于是制成所需要的培养基。在有些国家有厂家制作和厂家制作和销售售这种干粉培养基，我国市种干粉培养基，我国市场上目前上目前尚无供尚无供应。干粉培养基可用于常。干粉培养基可用于常规的的实验目的，如目的，如植物的快速繁殖等，在植物的快速繁殖等，在这类实验中所需的培养基成中所需的培养基成分是早已完全确定了的。在分是早已完全确定了的。在这种情况下，使用干粉种情况下，使用干粉培养基就可以培养基就可以节省省时间和金和金钱。34.l2.2.储备母液配制母液配制:(1)(1)浓缩贮备液的液的浓缩倍数：倍数：1)1)大量元素（大量元素（浓缩2020倍）；倍）；l2)2)微量元素（微量元素（浓缩200200倍）；倍）；l3)3)铁盐（浓缩200200倍）；倍）；4)4)除蔗糖之外的有机物除蔗糖之外的有机物质（浓缩200200倍）。倍）。l5)5)生生长调节物物质(浓度度:mg/ml,:mg/ml,分分别配制配制)（2 2）浓缩贮备液配制方法：液配制方法：l 以培养及以培养及为例，其例，其贮备液的配置如表液的配置如表3-63-6所示。所示。35.l表表3-6 MS3-6 MS贮备液的配制液的配制36.l（3 3）浓缩贮备液配制液配制时注意注意问题：l 1)1)在制在制备这4 4种种贮备液的液的时候，候，应使每种成分分使每种成分分别溶溶解，一粒不剩，然后再把它解，一粒不剩，然后再把它们彼此混合彼此混合;l 2)2)各种生各种生长调节物物质的的贮备液液应当分当分别配制，如果它配制，如果它们是不溶于水的，是不溶于水的，则应先把它先把它们溶解在很少量的适当溶溶解在很少量的适当溶剂中（中（见第第3 32.32.3节），然后再加蒸溜水到最），然后再加蒸溜水到最终容容积。l 3)3)生生长调节物物质浓度取决于所要求的生度取决于所要求的生长调节物物质的的水平，其水平，其贮备液的液的强度可以是度可以是mmolmmolL L，也可以是，也可以是10mmol10mmolL L。l 4)4)所有所有贮备液都液都应贮存于适当的塑料瓶或玻璃瓶中，存于适当的塑料瓶或玻璃瓶中，置冰箱中保存。置冰箱中保存。铁盐贮备液液须贮存于琥珀色玻璃瓶中，在存于琥珀色玻璃瓶中，在贮备椰子汁（液体胚乳）的椰子汁（液体胚乳）的时候，要先把由果候，要先把由果实中采集到中采集到的汁液加的汁液加热煮沸以除去其中的蛋白煮沸以除去其中的蛋白质，过滤，然后置塑料，然后置塑料瓶中瓶中贮存于一存于一2020的低温冰箱内。的低温冰箱内。l 5)5)作作为一一项规则，在使用，在使用这些些贮备液之前必液之前必须轻轻摇动瓶子，如果瓶子，如果发现其中有沉淀其中有沉淀悬浮物或微生物浮物或微生物污染，必染，必须立即将其淘汰。立即将其淘汰。l 6)6)在制在制备贮备液和培养基的液和培养基的时候，候，应当使用蒸当使用蒸馏水或水或无离子水，以及高无离子水，以及高纯度的化学度的化学试剂。37.l（4 4）常用固体培养基的配制步）常用固体培养基的配制步骤(以以1L1L为例例)：l 1 1）称出）称出规定数量的定数量的琼脂脂(7-10g)(7-10g)和蔗糖和蔗糖20-40g)20-40g)，加水直到培养基最加水直到培养基最终容容积的的1/2-3/4(500-700ml)1/2-3/4(500-700ml)，在恒温水浴中加在恒温水浴中加热使之溶解使之溶解,也可直接加也可直接加热或放入微或放入微波炉加波炉加热溶解。在配制液体培养基溶解。在配制液体培养基时则无无须加加热，因因为蔗糖甚至在微温的水中也能溶解。蔗糖甚至在微温的水中也能溶解。l 2 2）分）分别加入一定量的各种加入一定量的各种贮备液液:大量元素大量元素50ml;50ml;微量元素微量元素5ml;5ml;铁盐5ml;5ml;有机有机营养养5ml;5ml;生生长调节物物质和其他的特殊和其他的特殊补加物适量。如果由于特殊原加物适量。如果由于特殊原因有必要在高因有必要在高压灭菌之后再加入菌之后再加入维生素和生生素和生长素，素，那么在那么在调节了了PHPH值之后，可使之后，可使这些物些物质的溶液通的溶液通过孔径孔径为0 022220.45m0.45m的微孔的微孔滤器消毒。器消毒。l 38.l 3 3）加蒸）加蒸馏水直至培养基的最水直至培养基的最终容容积。l 4 4）充分混合之后，用）充分混合之后，用0.l mol0.l molL NaOH L NaOH 和和0.1mol0.1molL HCI L HCI 调节培养基的培养基的PHPH到到5.8-6.0,PH5.8-6.0,PH过低低,不易不易凝固凝固,过高培养基高培养基变硬。硬。l 5 5）把培养基分装到所）把培养基分装到所选用的培养容器中，每个用的培养容器中，每个 25 25 X 150mmX 150mm的的试管管约装培养基装培养基15ml15ml；每个；每个150ml150ml的三角的三角瓶瓶约装装50ml50ml。l如果在步如果在步骤2 25 5期期间培养基开始凝固，培养基开始凝固，应将装培养将装培养基的三角瓶置水浴中加基的三角瓶置水浴中加热，只有当培养基，只有当培养基为均匀的均匀的液液态时才能分装。才能分装。l 39.l6 6）用包在）用包在纱布中的棉塞（它能阻止微生物布中的棉塞（它能阻止微生物污染，染，但可使气体自由交但可使气体自由交换），或其他适宜的塞或盖），或其他适宜的塞或盖封封严瓶口。瓶口。l 7 7）把已装入了培养基的培养容器装在）把已装入了培养基的培养容器装在铁丝篮子里，外面包上一子里，外面包上一层铝箔以防止棉塞在高箔以防止棉塞在高压灭菌菌时吸湿，在吸湿，在120120（1.06kg1.06kgcm2cm2）下）下灭菌菌15min15min。40.