NIPT缁艰堪.pptx

NIPT综述部门：临床医学部姓名：曹光鑫日期：2017.122024/5/22 周三1NIPT以后能查什么！2024/5/22 周三2目录1染色体非整倍体2亚染色体异常3单基因遗传病4胎儿全基因组的构建2024/5/22 周三3染色体非整倍体（一）NIPT行行业进展展欧美等国在欧美等国在NIPT纳入国家入国家级医保系医保系统方面的方面的进展展2015年7月，瑞士首次将NIPT纳入国家级健康保险系统。英、美、德、日、法、荷兰、新西兰、比利时等许多国家均已开始进行NIPT普及的评估。2016年开始，我国多个地区陆续表示，建议将NIPT纳入医保。2024/5/22 周三4染色体非整倍体（二）NIPT纳入医保入医保势在必行在必行纳入医保的前提条件：入医保的前提条件：NIPT纳入医保是医入医保是医疗保障政策的大保障政策的大势所所趋，是行，是行业发展的必然展的必然结果！果！驱动力政策保障质量保障形成大规模的社会需求“近似于诊断的高精准度筛查技术”在临床应用中已有对应的政策规范2024/5/22 周三5仪器器试剂耗材耗材检测服服务分析分析软件件染色体非整倍体（三）NIPT市市场布局布局2024/5/22 周三6合并恶性肿瘤的孕妇应用限定产前筛查高风险，预产期年龄35岁的高龄孕妇保证cffDNA浓度技术限制孕周12周的孕妇高体重(体重100千克)孕妇双胎妊娠的孕妇染色体异常胎儿分娩史，夫妇一方有明确染色体异常的孕妇孕妇1年内接受过异体输血、移植手术、细胞治疗或接受过免疫治疗等对高通量测序产前筛查与诊断结果将造成干扰的通过体外受精-胚胎移植方式受孕的孕妇胎儿影像学检查怀疑胎儿有微缺失微重复综合征或其他染色体异常可能的各种基因病的高风险人群各种嵌合现象染色体非整倍体（四）NIPT技技术规范限制条件解范限制条件解读2024/5/22 周三7染色体非整倍体（五）胎儿游离胎儿游离DNADNA浓度度8种种检测方法方法方法方法优势优势不足不足1Y染色体估算法简单；准确不适用于女胎2基于SNP的胎儿特异SNP位点法直接；准确父亲DNA有时获取存在困难3基于SNP的深度靶向测序法仅需检测母体血浆DNA；准确需要深度测序（120X）4基于SNP 的低深度测序只需要对母体血浆DNA低深度测序；准确母亲基因分型需要额外成本；不同的基因分型和测序平台需要重新校准曲线5基于cfDNA片段数目只需要对母体血浆进行测序；单端测序；易于整合到现有的NIPT流程中需要大样本来建立网络模型；当cfDNA浓度低于5%时准确性差6基于甲基化标记的方法准确测序前用亚硫酸盐或者对甲基化敏感的酶切处理可能降低准确性；甲基化测序成本较高7基于cfDNA长度差异只需要对母体血浆进行低深度测序；易于整合到现有的NIPT流程中准确性一般；双端测序增加成本8基于核小体印迹法测序深度低准确性差；在构建模型时需要进行深度测序2024/5/22 周三8亚染色体异常（一）检测的必要性的必要性常染色体重复或缺失的片段较大的话对于胚胎是致死性的，如果片段较小（一般20Mb以内），胎儿存活，大部分表现为多发畸形、发育迟缓、智力低下等综合征。绝大多数微缺失综合征（5Mb以内）在宫内发育期间基本无异常表现。微缺失微重复疾病目前已发现近300种，合并发病率近1/600。其遗传特点常为显性发病，以新新发突突变为主(约占85%95%)，家族性遗传约占5%10%。最佳防控阶段：二二级预防防2024/5/22 周三9技术技术范围范围应用应用优点优点缺点缺点核型分析染色体组G 显带染色体核型分析可以检测出染色体平衡易位、倒位灵敏度低（3M）、耗时长、FISH目标片段特定目标筛选后的验证灵敏度高、耗时短、可检测平衡易位、倒位成本高、通量低、需要特异性探针、不适合大面积筛查BoBs目标片段特定目标技术简单、成本低、耗时短通量较低、需要特异性探针、不适合大面积筛查qPCR目标片段特定目标简单快速、廉价易行准确度低、通量低、MLPA目标片段特定目标技术简单、耗时短成本较高、技术复杂、通量低CMA染色体组UPD单亲二倍体LOH杂合缺失分辨率高、自动化高最主流的检测方法成本高、aCGH不能检测UPD，平衡易位SNP可以NIPT-plus染色体组UPD不行LOH可以非侵入式成本高、后期分析难度高亚染色体异常（二）常常见检测技技术及及优缺点缺点2024/5/22 周三10亚染色体异常（三）亚染色体异常的产前筛查与诊断方式针对特定目标的检测方式：FISH、BoBs全染色体组筛查方式：CMA+FISH；NIPT-plus+FISHNIPT-plus+FISH优缺点：非侵入分辨率高数据处理难度大2024/5/22 周三11应用用进展展ISPD在2015年8月更新了NIPT的临床指导意见。明确指出NIPT可以针对研究清楚的染色体微缺失/微重复综合征进行检测。2017年初，吉林省出台了NIPT-plus的地方标准。改改进措施措施提高cffDNA浓度增加测序深度改进生物信息学分析方法亚染色体异常（四）NIPT-plus的的应用用进展及改展及改进措施措施2024/5/22 周三122024/5/22 周三13五大类遗传病中，病种最多的当属单基因病。截止到17年初，OMIM正式收录的超过8000多种。遗传机制明确的有5000余种，一部分发病率高，危害性大的常见单基因病已能进行临床基因诊断。例如：遗传性耳聋、杜氏进行性肌营养不良（DMD）、和地中海贫血、先天性肾上腺皮质增生症（CAH）、枫糖尿病（MSUD）、血友病、镰状细胞病、威尔逊病.单基因遗传病（一）发病情况病情况2024/5/22 周三14单基因遗传病（二）分析方法分析方法致病机理明确的致病机理明确的单基因基因遗传病病实现临床应用的基础：科学基础：遗传基础明确、包括致病基因、遗传模式.技术基础：成熟的检测技术、可靠的分析方法.临床基础：技术定位、适用范围、风险、标准.致病机理不明的致病机理不明的单基因基因遗传病病家系分析：Trios模式检测方式：半定性检测、RMD、RHDO、GRAD2024/5/22 周三15一次人全基因组测序给出的原始变异位点可达400万个；一人全外显子组测序给出的原始变异位点可达2-5万个。对于WES来说，第一步、通过测序质量、变异位置、类型、MAF等指标的过滤，可选择的变异数可降至数千。第二步、与已知变异数据库或实验室内部建立的变异数据库比较，可将候选变异数再降低至数百。第三步、如果对一个家系中多个患者或携带者进行测序，还可通过综合分析，进一步降低候选变异数，从而使真正的变异“水落石出”。单基因遗传病（三）致病突致病突变位点的位点的筛选2024/5/22 周三16单基因遗传病（四）遗传家系分析家系分析2024/5/22 周三17单基因遗传病（五）检测方式方式半定性分析：父源性变异性连锁：Y/X突变基因连锁SNP：相对突变剂量分析（RMD）相对单体型剂量分析(RHDO)全基因组相对等位基因剂量分析（GRAD）2024/5/22 周三18单基因遗传病（六）RMD和和RHDORMDRHDO2024/5/22 周三19GRAD分析方法是RMD与全基因组测序技术结合的方法。GRAD策略可以通过高深度测序获得的高质量基因组信息直接检测母体血浆中杂合等位基因的序列信息，进而通过SPRT方法检测出母体中杂合等位基因的相对含量，在原理上与RMD策略相同。与全基因组测序RHDO不同的是GRAD无需构建母亲的单倍体型，并且高深度全基因组测序将检测的分辨率提升了约90倍。单基因遗传病（七）GRAD2024/5/22 周三20全基因组构建（一）有核有核红细胞胞有核有核红细胞胞优势：单核，拥有完整的胎儿基因组。孕早期胎儿血中含量丰富且孕妇外周血中罕见。形态上易于辨认表面有多种特异性的抗原，作为细胞标记而利于细胞的分类、鉴定和聚集。其在孕妇外周血中的生存期短（90天），不会持续到下一次妊娠。2024/5/22 周三21全基因组构建（二）FNRBC富集分富集分选及及鉴定定NRBC富集分富集分选方法方法密度梯度离心：25倍显微镜操作抗原/抗体：流式、磁珠亲和素：SBA电荷流分离法：产量高、纯度低定向诱导培养法端粒长度FNRBC鉴定方法定方法：多个X-STR位点联合AMXY基因扩增显微镜观察：染色、形态2024/5/22 周三22全基因组构建（三）单细胞全基因胞全基因组的构建的构建单细胞基因胞基因组扩增增模板依赖性多重置换扩增技术（tdMDA）多次退火循环扩增技术（MALBAC）乳液全基因组扩增技术（eWGA）转座子插入线性扩增（LIANTI）扩增增产物分析物分析NGSCMA2024/5/22 周三23全基因组构建（四）研究研究进展展2016年7月，解放军总医院戴朴教授申报的常见单基因病及基因组病无创产前筛查及诊断技术平台研发及规范化应用体系建立获批“十三五”首批国家重点研发计划重点专项。此项目致力于母血胎儿游离核酸分离富集及分析技术，开发NIPT新算法以及胎儿有核红细胞识别捕获，研发基于有核红细胞的NIPT新技术和平台，突破传统无创产前检测的瓶颈。目前已经有通过FNRBC检测单基因病如DMD、CAH、地贫、先天性耳聋的报道。2024/5/22 周三24检测技技术的革新的革新三代三代测序（序（3GS）优点：点：测序读长较长避免了PCR扩增带来的出错拓展了测序技术的应用领域缺点：缺点：总体上单读长的错误率依然偏高依赖DNA聚合酶的活性2024/5/22 周三25END2024/5/22 周三26