第二章磺胺二甲嘧啶抗体的制备.doc

个人收集整理 勿做商业用途
第二章 磺胺二甲嘧啶抗体的制备

引言
免疫分析是以抗原抗体间的特异性反应为基础，其作为一种特殊的分析技术，近几年在兽药和农药等小分子化合物的残留分析中的应用越来越广泛，抗体是该技术中的核心试剂。临床上使用的抗体主要有多克隆抗体（polyclonal antibody,PcAb）和单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）两类.McAb是由一个祖代B淋巴细胞通过无性繁殖所产生的基因组相同，表现性状一致的细胞群所产生的免疫球蛋白。McAb针对某一特定的抗原决定簇或表位，并且由于均来源于同一祖代B淋巴细胞，其结构相同、特异性强，生物活性高，在免疫特性和理化性质等方面高度一致；具有均一性，专一性和无限量供应等特点，非常利于标准化。PcAb是直接免疫动物获得抗血清，由于抗原物质具有多种抗原决定簇所以用该法获得的抗血清是多种特异性不同的抗体混合物称为多克隆抗体。多克隆抗体也称为第一代抗体,虽然简单易得但产量有限，效价不稳定。
本研究用合成的完全抗原SM2—BSA免疫小鼠，此时小鼠脾细胞具有分泌抗体的能力;同时扩大培养SP2/0骨髓瘤细胞，SP2/0细胞具有连续繁殖的能力;将免疫后鼠脾脏细胞和SP2/0骨髓瘤细胞在PEG的作用下融合，利用选择性培养基选择培养杂合体细胞，通过ELISA进行阳性测定，克隆化筛选，选择出合适的阳性杂交瘤细胞株;细胞株扩大培养后，通过动物体内诱生的方法，制备了大量的含有单克隆抗体(McAb )的腹水;腹水经纯化,可得到高纯度的抗体，采用ELISA等方法对单抗亲和性及对抗原的特异性等性质进行考察。同时对新西兰大白兔进行免疫，制备出抗磺胺二甲嘧啶的多克隆抗体，在对抗题进行鉴定后，选取好的抗体继续建立酶联免疫分析方法和对新型检测方法进行探索。

磺胺二甲嘧啶单克隆抗体的制备

材料与方法
实验材料
主要仪器
医用净化工作台（北京设备厂)；CO2恒温培养箱〔OPTIMA〕；光学倒置显微镜（OLYMPUS）；台式低速离心机（HERMLT）；酶联免疫检测仪(SPECTRAIII)；微量移液器（2~20μl 、20～200μl、200~1000μl， 德国，Eppendorf)。
主要材料与试剂
BSA—SM2（防化学院范崇旭博士提供）;磺胺二甲嘧啶（SM2）；牛血清白蛋白(BSA）；卵清蛋白（OVA)；碳二亚胺（EDC）；福氏完全佐剂(FCA）；福氏不完全佐剂（FICA）；二甲基亚砜(DMSO);辣根过氧化物酶（HRP)；胎牛血清（FBS)；DMEM培养基；谷氨酰胺；HAT;HT；PEG以上均购自sigma公司；细胞96孔、24孔培养板；96孔酶标板；细胞培养瓶均购自costar公司；Balb/C小鼠、新西兰大白兔，中国医学科学院实验动物研究所。
实验方法
抗原联接:采用碳二亚胺法联结SM2和BSA,投料比为1分子BSA对100分子SM2.（1#免疫原）
免疫程序 以范博士提供(2#免疫原）的和自己联接的BSA—SM2作为免疫原，选用6—8周龄雌性BALB/c小鼠5只，取免疫抗原100μg（以蛋白含量计算)，加生理盐水、弗氏佐剂乳化后。按照常规免疫程序对BALB/C小鼠进行背部皮下多点注射免疫。每次免疫时间间隔为4周,免疫4～5次后采集血清并测定滴度。小鼠在融合前3天开始进行腹腔注射加强免疫。
表 BALB/C小鼠的免疫方案
Table Immunization protocol

免疫次数
Immunity times
佐剂类型
Adjuvant
间隔时间
Interval（d)
抗原量（μg/只）
Ammount
注射部位
Injection sites
基础免疫
弗氏完全佐剂
14
20
颈背部皮下多点
第1次加强
弗氏不完全佐剂
28
10
颈背部皮下多点
第n次加强
弗氏不完全佐剂
28
10
颈背部皮下多点
腹腔加强
生理盐水
融合前3天
10
腹腔

抗磺胺二甲嘧啶单克隆抗体细胞株的建立
骨髓瘤细胞的复苏和培养：从液氮罐中取出冰冻的骨髓瘤细胞，将冻存管迅速放入37℃水浴中，快速复苏，将冻存的细胞悬液融化后以8OOrpm离心5min，弃去上清液，加入约5m1 GEN培养基，置于37℃ C02培养箱中培养。细胞经换液、传代扩大培养，直至细胞状态良好、细胞数目增多可供细胞融合之用.
融合：经过三次加强免疫后，对小鼠进行眼底采血，抗血清具有较高滴度即可进行融合。将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）按10-2：1的比例在50%PEG（Mr：1，200～1,600)作用下融合。融合后的细胞至于培养基中，铺于含有饲养细胞的96孔培养板内，在37℃，5%CO2的培养箱中培养［2,3］。
筛选：待细胞群落长至1／4孔大小时,采用ELISA方法进行筛选。
包被板制备:包被浓度0。5μg／ml,包被体积100μl/孔,4℃放置过夜，洗涤一次，以200μl／孔封闭液37℃封闭包被板1h,拍干，4℃放置.
分析方法：100μl／孔温浴液（阴性对照)或100μl／孔细胞上清或100μl／孔阳性血清（阳性对照），37℃温育1h，洗涤三次，100μl／孔羊抗小鼠二抗－HPR，37℃温育0.5h，洗涤三次，100μl／孔TMB（H2O2） 37℃显色15min，50μl／孔2M H2SO4终止反应，450nm测量O.D.值。
克隆化:将细胞上清液呈阳性的细胞株按有限稀释法进行克隆化，待细胞长至1/5空时筛选、克隆，直至全部细胞上清液呈阳性为止。
诱发腹水:将已成功克隆的细胞扩大培养后，以5×105个细胞／只的剂量接种于用降植烷处理的Balb/c小鼠腹腔内，7~8天后即可获得含阳性单克隆抗体的小鼠腹水。腹水经沉淀离心后去上清备用。
抗体鉴定：
抗体滴度测定：采集来的腹水进行倍比稀释后，用ELISA法测定其IC50时的腹水稀释倍数。
抗体亲和常数测定：按照Beatty等提出的方法测定抗磺胺二甲嘧啶的抗体亲和常数[4］。抗体十倍倍比稀释与二倍倍比稀释包被原,通过ELISA方法测定，以抗体的不同稀释浓度为横坐标，测定的相应OD值为纵坐标，绘出不同浓度的抗原反应曲线，从反应曲线上针对每一包被原的浓度读出最大吸光度值OD—50一半时对应抗体浓度，利用下列公式确定Kaff:
Kaff=（n-1)/2(n（Ab’)t-（Ab)t）
N=(Ag)t/(Ag’)t
其中(Ag）t和（Ag’)t分别为两个不同的包被浓度,（Ab）t 和（Ab’)t 为对应包被原浓度(Ag)t和（Ag’）t时，达到O。D—50时的抗体浓度。
抗体特异性测定：对SM2抗体采用ELISA方法，对类似物测定其交叉
蛋白G亲和层析法提纯抗体：用亲和层析柱纯化抗体，腹水经缓冲液（PB， 0.02mol/L， pH 7。4)适当稀释后,上样用于平衡缓冲液平衡好的亲和柱，用平衡缓冲液彻底洗去杂蛋白后，换洗脱液(Gly—HCI， O.1mol/L. pH 2。8）将抗体洗下，洗下的抗体立即用中和缓冲液(Na2HPO4, 0。2mol/L， pB9。0)中和，使pH恢复至7.0左右，以免失去活性。
抗体特异性鉴定
将SM2、SMX、SMP、SMM、SQX 、STZ、SDZ、SAM进行倍比稀释,每个浓度分别取50μl加入到包被封闭好的酶标板微孔内，再加入50μl最适工作浓度的抗体37℃温育反应1小时，其余步骤同ELISA筛选操作流程.计算各竞争物中的IC50，按下列公式计算各竞争物与SM2抗体的交叉反应率。

SM2IC50 (ng/ml)
交叉反应率(%）=—-————————- X 100
竞争物IC50 （ng/ml）

结果与分析
融合与筛选结果
研究进行了7次融合实验，经细胞筛选与克隆共获得11株阳性细胞株，具体见下表:
表
Table

融合次数
免疫原
结果
1
SM2—OVA
SM2 2A3
SM2 2B9
SM2 2G7
SM2 4G11
SM2 4H3
2
防化学院
未融合上
3
防化学院
SM2 7H7
4
防化学院
无阳性
5
防化学院
SM2-17A6
6
防化学院
SM2-23E1
SM2-24H3
7
防化学院
SM2—25C4
SM2—27F4

2．不同细胞株诱发腹水效价及10ng SM2 抑制情况
抗体效价是评价抗体性能的一个重要指标，本研究采用间接ELISA法测定抗体在不同稀释倍数情况下的结合情况，以最高结合一半时认定为抗体效价，结果如下：
表
table
编号
27F4
25C4
24H3
23E1
17A6
7H7
4H3
4G11
2G7
2B9
2A3
滴度
5E6
5E5
2E5
5E5
1E3
3E3
1E7
2E6
1E7
3E5
2E5

为了检验抗体是否能够应用于免疫竞争反应，我们选取一定稀释度的腹水与等体积含0、10ng/ml SM2标准品溶液混合加入包被有一定浓度的BSA-SM2 的酶标板内反应，检验其（O。D450 10ng/ml）/ （O.D450 0ng/ml）。由于磺胺二甲嘧啶单个药物的LOD为10ng/ml,我们用10ng/ml的磺胺二甲嘧啶作为竞争物来考察抗体能够达到足够的检测灵敏度。
表
table
编号
27F4
25C4
24H3
23E1
17A6
7H7
4H3
4G11
2G7
2B9
2A3
工作浓度
5E6
5E5
2E5
1E5
1E2
1E3
5E6
1E6
5E6
2E5
2E5
O.D450 10ng
1.378
0。805
0.282
0。645
1。076
1。142
1.659
1。076
1。346
1.375
3.014
O。D450 0ng
1。252
0。875
0。534
1.911
0。971
1.311
1。736
0。975
1.299
1.509
2。799
从以上结果中可以看出仅23E1可以达到检测灵敏度，是所得到的11株抗体中唯一一株可以应用于免疫反应的单克隆抗体。

抗体亲和性
经过7次融合实验我们获取了11（27F4、25C4、24H3、23E1、17A6、7H7、4H3、4G11、2G7 、2B9、2A3)株单抗,但只有1株23E1既有滴度同时又可以做出抑制曲线。按照Beatty等提出的方法对其亲和常数进行测定，得到如下结果：

表1抗体亲和常数
抗体编号
23E1
Ka L/Mol
3。5×108

3。2抗体特异性
用酶联免疫分析法（ELISA）测定其与其他几种磺胺类药物的交叉反应率:
表2 抗体与其他磺胺类药物的交叉反应率
交叉物
SM2
SMZ
SMP
SMM
SQ
ST
SDZ
SAM
23E1
100%
—
-
-
-
〈0.05％
〈0.05%

数据表明所制备的单抗23E1与SM2交叉反应率为100%，与磺胺嘧啶（SDZ)、磺胺噻唑（STZ）交叉反应率<0。01%，与其他磺胺类药物基本无交叉。

磺胺二甲嘧啶多克隆抗体的制备
实验动物—新西兰大白兔,中国医学科学院实验动物研究所。
主要试剂：同单抗制备
实验方法
免疫方案
新西兰大白兔3只，平均体重2。0kg,单笼饲养。基础免疫：取适量合成的免疫原，用灭菌生理盐水稀释后与等体积的弗氏完全佐剂混匀。每只兔子注射抗原量为100μg/mL.经背部皮内多点注射；两周后进行第一次加强免疫时将弗氏完全佐剂更换为弗氏不完全佐剂，颈背部皮下多点注射.此后每四周进行一次加强免疫,三次加强免疫后第7天，兔耳缘静脉采1ml全血，取血清,用间接EL15A测定血清效价。效价达到要求后，即可颈动脉采血。

表 新西兰兔的免疫方案
Table Immunization protocol
免疫次数
Immunity times
佐剂类型
Adjuvant
间隔时间
Interval（d）
抗原量(μg/只）
Ammount
注射部位
Injection sites
基础免疫
弗氏完全佐剂
14
200
背部皮下多点
第1次加强
弗氏不完全佐剂
28
100
背部皮下多点
第n次加强
弗氏不完全佐剂
28
100
背部皮下多点

抗血清滴度测定
ELISA测定具体步骤如下:用包被缓冲液将包被抗原稀释至适当的工作浓度，每孔加100μl,4℃冰箱过夜，取出板弃去孔内液体；每孔加封闭液200μl,37℃温箱温育1h后，用洗涤缓冲液洗三遍；将SM2多抗血清倍比稀释后每孔加入100μl，37℃温箱温育1h后，用洗涤缓冲液洗三遍;每孔加入1:5000辣根过氧化物酶标记的驴抗兔IgG—HRP 100μl/ml, 37℃温箱温育0.5h后，用洗涤缓冲液洗三遍，每孔加新鲜配制的TMB-H2O2底物液100μl,37℃温箱温育15min；每孔加终止液硫酸50μl,上酶标仪测O。D450.值。以待测血清的OD最高值的一半处判定为血清滴度.
抗体抑制情况测定—将磺胺二甲嘧啶标准品配制成1ng/ml， 10ng/ml，100ng/ml，1μg/ml,10μg/ml系列浓度，取50μl加入到包被好的酶标板中，再加入50μl适当浓度的兔血清，37℃反应1hr后洗涤，加入100μl酶标驴抗兔二抗37℃反应0.5hr后加入显色剂显色，观察标准品的加入是否能抑制抗体与包被抗原的结合。
抗体亲和常数测定—方法同单抗
抗体特异性测定—方法同单抗
实验结果与分析
免疫结果与血清滴度
先后1#免疫原与2#免疫原分别免疫3只新西兰大白兔，情况如下:
表 免疫批次情况

第一批
1＃免疫原
1
滴度高无抑制,弃
2
3
第二批
2#免疫原
2508
取血前死
滴度
2510
获取血清
2E6
2512
获取血清
2E6

采用1＃免疫原加强免疫3次后开始采血进行滴度和抑制性测试,所获血清均滴度较高却毫无抑制性。而采用2＃免疫原所免疫动物的血清产生良好的滴度和抑制性。其中2510＃与2512#抗体的滴度曲线如下：

图 SM2多抗2510＃、2512＃滴度曲线

抗体亲和常数测定
采用Beatty等提出的方法对其亲和常数进行测定，得到如下结果：

图表 SM2多抗2510#、2512＃亲和常数测定

表 SM2多抗2510＃、2512#亲和常数测定
抗体编号
2510
2512
Ka L/Mol
9.5×108
2.2×108

抗体特异性
用酶联免疫分析法（ELISA）测定其与其他几种磺胺类药物的交叉反应率：
表 SM2多抗2510#、2512＃交叉反应测定
交叉物
SM2
SMX
SMP
SMM
SQX
STZ
SDZ
SAM
2510
100%
—
—
-
—
<0。01%
〈0。01％
-
2512
100％

〈0.01%
〈0.01%

数据表明所制备的多抗与SM2交叉反应率为100%，与磺胺嘧啶（SDZ）、磺胺噻唑（STZ）交叉反应率〈0。01％，与其他磺胺类药物基本无交叉。
讨论
a、磺胺二甲嘧啶是小分子化合物，分子量278。32，不具有免疫原性，不能直接用作免疫原，只有把这些半抗原和大分子物质结合后,才具有免疫原性，刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞。因此我们先后采用碳二亚胺法和琥珀酸酐—碳二亚胺法联结的人工免疫原免疫动物。在第一批采用碳二亚胺法所免疫的动物中，虽然无论是多抗还是单抗在和其免疫原的结合上都具有很高的效价，但在用磺胺二甲嘧啶对其作抑制曲线时均显示磺胺二甲嘧啶标准品的添加无法抑制所获得抗体和其包被抗原之间的结合，即我们所获得的抗体不仅仅是针对人工抗原中的磺胺二甲嘧啶部分。而用琥珀酸酐-碳二亚胺法联结的人工抗原所免疫动物获得的单抗和多抗则既具有较高的效价又同时能被磺胺二甲嘧啶标准品所抑制，是我们需要的抗磺胺二甲嘧啶的抗体。分析原因应该是人工抗原的联结方法所致：

图1 人工免疫原碳二亚胺法联结示意图

图2 琥珀酸酐-碳二亚胺法联结示意图

应用碳二亚胺法联结的人工免疫原小分子药物与大分子蛋白之间并没有桥梁所以小分子药物很容易折叠进蛋白的三级结构中去，不能够发挥独立的抗原决定簇的作用，而是与周围蛋白的结构共同作为决定簇产生抗体。因此该抗体是无法与单独的磺胺二甲嘧啶分子相结合的，也就无法被磺胺二甲嘧啶标准品抑制其与人工免疫原之间的结合。而琥珀酸酐—碳二亚胺法通过对小分子药物的改造在小分子与载体蛋白之间引入了一个4碳结构臂,从而将小分子药物暴露出载体蛋白，使其可以作为独立的抗原决定簇产生抗体，因而其抗体是针对磺胺二甲嘧啶分子的，也就可以被磺胺二甲嘧啶标准品抑制其与人工免疫原之间的结合［7]。
b、本研究中制备了抗磺胺二甲嘧啶的单克隆抗体和多克隆抗体。一般说来McAb的优点是高度均质性，杂交瘤技术一旦建立，即可源源不断提供性能均一的McAbs，试剂与方法易于标准化和商品化.但是在本次方法学的建立中所采用的抗体是多抗而非单抗。原因是实验中所制备的单抗亲和性和灵敏度都不及多抗。分析原因可能是筛选细胞株时所用的包被抗原是免疫用的免疫原(SM2—BSA）的缘故。所筛选出的抗体针对的不仅仅是磺胺二甲嘧啶部分还有一部分是其载体蛋白BSA或者是两者的连接部位.应在以后的实验中用不同的载体蛋白如卵清蛋白（OVA）的联结物做包被物筛选出只针对磺胺二甲嘧啶的抗体.
C、所制备抗体均与SDZ和STZ有一定交叉，从分子结构上看

本章小节
采用琥珀酸酐—碳二亚胺法联结的人工免疫原免疫效果要好于采用碳二亚胺法联结的免疫原.可以得到针对磺胺二甲嘧啶抗原决定簇的抗体.
制备出了抗磺胺二甲嘧啶单克隆抗体SM223E1和多克隆抗体2510#、2512＃，亲和常数分别为3。5×108 、9.5×108和2。2×108 L/Mol 满足免疫分析的检测要求.

本章参考文献