《基因工程施工》PPT教学.ppt

2我们主要讨论我们主要讨论4 4个问题：个问题：1.什么是基因工程什么是基因工程基因工程的概念。基因工程的概念。2.为什么能进行基因工程为什么能进行基因工程基因工程的原理和技术。基因工程的原理和技术。3.怎样进行基因工程怎样进行基因工程4大步骤大步骤4.基因工程的应用和前景基因工程的应用和前景1、概念：、概念：又叫做又叫做基因拼接技术基因拼接技术或或DNA重组技术重组技术。通。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，物的细胞里，定向定向地改造生物的地改造生物的遗传性状遗传性状。原原 理理：表达水平表达水平：过程：过程：基因重组基因重组DNADNA分子水平分子水平1 1、定向改造某些性状、定向改造某些性状2 2、克服远缘杂交、克服远缘杂交意义：意义：原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子终止子：终止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片断，它能阻片断，它能阻碍碍RNARNA聚合酶的移动，并使其从聚合酶的移动，并使其从DNADNA模板链上脱离下来，模板链上脱离下来，使转录终止。使转录终止。RNARNA聚合酶聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质的一种蛋白质.(.(以模板转录然后脱落以模板转录然后脱落)启动子：启动子：位于基因首端一段能与位于基因首端一段能与RNARNA聚合酶结合并能起聚合酶结合并能起始始mRNAmRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。不能转录为信使不能转录为信使RNARNA，不能，不能 编码蛋白质。编码蛋白质。：能转录相应的信使：能转录相应的信使RNARNA，能，能 编码蛋白质编码蛋白质 编码区编码区非编码区非编码区原核原核细胞细胞的的 基因基因结构结构在遗传信息的表达过程中在遗传信息的表达过程中起着调控作用起着调控作用非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 启动子启动子终止子终止子编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点内含子内含子 外显子外显子 能够编码蛋白质的序列叫做外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子（但能转录为（但能转录为mRNAmRNA，转录后剪切掉），转录后剪切掉）启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子：内含子：外显子：外显子：真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构真核真核细胞细胞的的 基因基因结构结构编码区编码区非编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：在遗传信息的表达过程中起在遗传信息的表达过程中起着调控作用着调控作用原原核核细细胞胞 真真核核细细胞胞不不 同同 点点相相 同同 点点原核细胞与真核细胞基因结构比较：原核细胞与真核细胞基因结构比较：非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区 都由能够都由能够编码蛋白质编码蛋白质的编码区和的编码区和具有具有调控作用调控作用的非编码区组成的非编码区组成编码区是编码区是连续连续的的编码区是间隔的，编码区是间隔的，不连续不连续的的外显子外显子 内含子内含子 启动子启动子终止子终止子（1）20世纪40年代，Avery 通过 肺炎双球菌体外转化实验，确定了生物遗传物质的化学本质是DNA;（2）19世纪50年代James D.Watson和Francis H.C.Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制，解决了基因的自我复制和传递的问题。2.基因工程的三大理论基础基因工程的三大理论基础(3)1958年Crick又提出了遗传信息传递的“中心法则”;1964年Marshall Nirenberg和Gobind Khorana等破译了64个遗传密码，从而阐明了遗从而阐明了遗传信息的流向和表达问题传信息的流向和表达问题1基因拼接(1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。(2)双链双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。碱基互补配对原则碱基互补配对原则基因工程诞生的理论基础基因工程诞生的理论基础2外源基因在受体内表达(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。基因是控制生物性状的独立遗传单位。(2)遗传信息的传递都遵循中心法则阐述的信息流遗传信息的传递都遵循中心法则阐述的信息流动方向。动方向。(3)生物界共用一套遗传密码。生物界共用一套遗传密码。二、基因工程操作的工具二、基因工程操作的工具1.1.基因的基因的“剪刀剪刀”限制性核酸内切酶（限制酶）限制性核酸内切酶（限制酶）一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割列，并在特定的切点上切割DNADNA分子。分子。专一性专一性如如:EcoRI限制酶限制酶被同一种限制酶切断的几个被同一种限制酶切断的几个DNADNA是否具是否具有相同的黏性末端？有相同的黏性末端？思考思考:GAATTCCGTAGAATTCGGATT 尝试写出下列序列受尝试写出下列序列受EcoRI限制酶作用后的黏性末端限制酶作用后的黏性末端CTTCATGAATTCCCTAA GAAGTACTTAAGGGATT CTTAAGGCATCTTAAGCCTAA CTTCATG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA GGGATT 练一练GGCATCTTAAAATTCCGTAG、基因的针线、基因的针线DNADNA连接酶连接酶连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接起来（磷酸二脂键），使之成为一个完整端连接起来（磷酸二脂键），使之成为一个完整的的DNADNA分子。分子。基因的针线：基因的针线：DNA连接酶连接酶G A A T T CC T T A A GG A A T T CC T T A A GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C G用同种限制酶切割用同种限制酶切割3 3、基因的运输工具、基因的运输工具运载体运载体 常常用用的的运运载载体体：质质粒粒、噬噬菌菌体体和和动植物病毒等动植物病毒等标记基标记基因，便因，便于进行于进行检测。检测。质粒存在于质粒存在于许多细菌和酵母许多细菌和酵母菌等生物中菌等生物中,是细是细胞染色体外能够胞染色体外能够自主复制的很小自主复制的很小的环状的环状DNADNA分子。分子。三、基因工程的基本操作程序三、基因工程的基本操作程序v目的基因的获取目的基因的获取v基因表达载体的构建基因表达载体的构建v将目的基因的导入受体细胞将目的基因的导入受体细胞操作过程操作过程操作过程操作过程v目的基因的检测与表达产物的测定目的基因的检测与表达产物的测定（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取1 1、什么是目的基因？、什么是目的基因？请举出三个以上的例子请举出三个以上的例子2 2、获取目的基因的常用方法有哪些、获取目的基因的常用方法有哪些?（1 1）直接从供体细胞中分离基因（鸟枪法）直接从供体细胞中分离基因（鸟枪法）（2 2）人工合成法人工合成法目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、（抗病毒、（抗病毒、（抗病毒、抗细菌抗细菌抗细菌抗细菌)、人胰岛素基因等人胰岛素基因等。a a、DNADNA变性变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火、退火（复性复性55-6055-60）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端端延伸，合成与模板互补延伸，合成与模板互补 的的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因反转录法：反转录法：以目的基因转录成以目的基因转录成的信使的信使RNARNA为模板，反为模板，反转录成互补的单链转录成互补的单链DNADNA，然后在酶的作用下合，然后在酶的作用下合成双链成双链DNADNA，从而获得，从而获得所需的基因。所需的基因。目的基因的目的基因的mRNAmRNA杂交双链杂交双链(单链单链RNA/RNA/单链单链DNA)DNA)单链单链DNADNA反转录酶反转录酶DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNADNA(目的基因目的基因)1.1.用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。2.2.用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _。核心核心3.3.将切下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处，再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同(二二)基因表达载体的构建基因表达载体的构建方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌介导的遗传转化法农杆菌介导的遗传转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞感受态细胞吸收吸收DNADNA分子分子(氯化钙法氯化钙法)（三）将目的基因导入受体细胞（三）将目的基因导入受体细胞(四四)目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功检测检测形态检测形态检测分子检测分子检测GACATAGCTACAGACATAGCTACA非目的基因片段非目的基因片段 CTGTATCGATGTCTGTATCGATGTGTACAGCGTAGTACAGCGTA基因探针基因探针GTACAGCGTAGTACAGCGTAGACATAGCTACAGACATAGCTACA非目的基因片段非目的基因片段 CTGTATCGATGTCTGTATCGATGT基因探针基因探针GTACAGCGTAGTACAGCGTATACGTCATGTCGCATGCTAGTACGTCATGTCGCATGCTAG目的基因片段目的基因片段 ATGCAGTACAGCGTACGATCATGCAGTACAGCGTACGATC基因探针基因探针TACGTCATGTCGCATGCTAGTACGTCATGTCGCATGCTAG目的基因片段目的基因片段 ATGCAGTACAGCGTACGATCATGCAGTACAGCGTACGATCGTACAGCGTAGTACAGCGTA基因探针基因探针 目的基因插入目的基因插入TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA上上 农杆菌农杆菌 导入植物细胞导入植物细胞 整合到受体细胞的染色体上整合到受体细胞的染色体上 目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达 1.1.农杆菌特点：农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物。易感染双子叶植物和裸子植物。TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA可转移至受体细胞的染色体上可转移至受体细胞的染色体上2.转转化化花粉管通道法花粉管通道法2.微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞3.转化方法：转化方法：大肠杆菌大肠杆菌繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少处理细胞细胞表达载体与感受态细胞混合 _细胞吸收DNA分子。Ca2+感受态感受态感受态感受态1.常用菌：常用菌：一一、植物基因工程硕果累累、植物基因工程硕果累累 植物基因工程主要用于提高农作物的植物基因工程主要用于提高农作物的抗抗性、抗逆能力性、抗逆能力,以及以及改良农作物的品质改良农作物的品质和利和利用植物用植物生产药物生产药物等方面等方面,克服了远缘杂交的克服了远缘杂交的障碍。障碍。1、抗虫抗虫转基因植物转基因植物2、抗病抗病转基因植物转基因植物3、抗逆抗逆转基因植物转基因植物4、利用转基因、利用转基因改良改良植物的品质植物的品质5、生产药物、生产药物典型例子：转基因抗虫棉典型例子：转基因抗虫棉Bt毒蛋白基因毒蛋白基因 抗虫的基因来自抗虫的基因来自苏苏云金杆菌云金杆菌。典型例子：抗烟草花叶病毒的转基因烟草、典型例子：抗烟草花叶病毒的转基因烟草、抗病毒的转基因小麦、甜椒抗病毒的转基因小麦、甜椒转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转黄瓜抗青枯病基因的甜椒3.3.抗逆转基因植物抗逆转基因植物4.4.利用转基因改良植物的品质利用转基因改良植物的品质富含赖氨酸的转基因玉米富含赖氨酸的转基因玉米不会引起过敏的转基因大豆不会引起过敏的转基因大豆转转入入荧荧光光素素酶酶蛋蛋白白基基因因的的发发荧荧光光烟烟草草二、动物基因工程前景广阔二、动物基因工程前景广阔1、提高生长速度、提高生长速度2、改善畜产品的品质改善畜产品的品质3、生产药物、生产药物1.1.用于提高动物生长速度用于提高动物生长速度原因：外源生长激素基因的表达可以使原因：外源生长激素基因的表达可以使 转基因动物生长更快转基因动物生长更快转基因鲤鱼转基因鲤鱼超级小鼠超级小鼠超级小鼠超级小鼠3.3.用转基因动物生产药物用转基因动物生产药物（重点）（重点）优点：优点：产量高、质量好、产量高、质量好、成本低、易提取成本低、易提取乳腺生物反应器乳腺生物反应器过程：过程：1、重组、重组药用蛋白基因药用蛋白基因与与乳腺蛋白基因的乳腺蛋白基因的启动子启动子2、用显微注射法导入到、用显微注射法导入到受精卵受精卵3、将受精卵送入母体生长发育、将受精卵送入母体生长发育4、转基因动物进入泌乳期后，提取乳汁、转基因动物进入泌乳期后，提取乳汁在传统的药品生产中，某些药品如胰岛素、干扰素在传统的药品生产中，某些药品如胰岛素、干扰素直接生物体的哪些结构中提取？直接生物体的哪些结构中提取？药品直接从生物的药品直接从生物的组织组织、细胞细胞或或血液血液中提取。中提取。传统生产方法的缺点传统生产方法的缺点 由于受原料来源的限制，由于受原料来源的限制，价格价格十分十分昂贵昂贵。可利用什么方法来解决上述问题？可利用什么方法来解决上述问题？利用利用基因工程基因工程方法方法高效率高效率地生产出各种地生产出各种高质量高质量、低成本低成本的药品。的药品。三、基因工程药物异军突起三、基因工程药物异军突起基因工程药品基因工程药品 胰岛素（糖尿病）胰岛素（糖尿病）基因工程药品基因工程药品 干扰素（抗病毒）干扰素（抗病毒）基因工程药品基因工程药品 乙肝病毒疫苗（免疫预防）乙肝病毒疫苗（免疫预防）四、基因治疗曙光初照四、基因治疗曙光初照初期临床阶段初期临床阶段基因基因诊断诊断：检测致病基因或疾病相关基因的检测致病基因或疾病相关基因的改变，或患者体内病原体所特有的核苷酸序列，改变，或患者体内病原体所特有的核苷酸序列，以此作为疾病诊断的指标。以此作为疾病诊断的指标。基因治疗基因治疗：把正常的外源基因导入有基把正常的外源基因导入有基因缺陷的因缺陷的某些功能某些功能细胞中，使该基因的表细胞中，使该基因的表达产物发挥功能，达到治疗疾病的目的。达产物发挥功能，达到治疗疾病的目的。DNA探针、探针、DNA分子杂交技术分子杂交技术基因治疗基因治疗l体外基因治疗体外基因治疗 先从病人体内获得某种细先从病人体内获得某种细胞，然后在体外完成基因转移，再筛选成功转胞，然后在体外完成基因转移，再筛选成功转移的细胞扩增培养，最后重新输入患者体内。移的细胞扩增培养，最后重新输入患者体内。l体内基因治疗体内基因治疗 直接向人体组织细胞中转直接向人体组织细胞中转移基因的治病方法。移基因的治病方法。eg:腺苷酸脱氨酶基因的转移腺苷酸脱氨酶基因的转移