流感的相关知识及实验室检测.ppt

流感的相关知识及实验室检测流感的相关知识及实验室检测陈宪楷陈宪楷2018.5.24流感的相关知识回顾流感的相关知识回顾1流感病毒的实验室检测流感病毒的实验室检测2流感病毒亚型的鉴定流感病毒亚型的鉴定3实验室检测的相关影响因素分析实验室检测的相关影响因素分析4C流感病毒流感病毒流感的相关知识回顾流感的相关知识回顾1 流感流感是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病。是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病。人类的流行性感冒病毒人类的流行性感冒病毒(influenza,(influenza,简称流感），简称流感），属正粘液病毒科，分属正粘液病毒科，分 A A（甲）、（甲）、B B（乙）、（乙）、C（丙）（丙）三型，呈球形或丝状，是一种造成人类及动物患三型，呈球形或丝状，是一种造成人类及动物患流行性感冒的负链流行性感冒的负链RNARNA病毒。病毒。流感病毒的基因组流感病毒的基因组RNA与NP构成RNP基因组由基因组由8 8个短的单链个短的单链 RNA RNA构成，包含构成，包含1111个基因，编码个基因，编码1111个蛋白：个蛋白：血凝素血凝素(HA),(HA),神经氨酸酶神经氨酸酶(NA),(NA),核蛋白核蛋白(NP),M1,M2(NP),M1,M2，NS1,NS2NS1,NS2（NEPNEP：核输出蛋白），：核输出蛋白），PA,PB1PA,PB1（聚合酶基团（聚合酶基团1),PB1-F21),PB1-F2和和 PB2 PB2。甲型甲型流感流感致病性强致病性强哺哺乳乳类类动动物物（猪猪，鲸鲸鱼鱼，马马，海海豹豹和和猫猫）或或禽类都会被广泛感染禽类都会被广泛感染容容易易发发生生突突发发性性变变异异，从从而而引引起起普普遍遍性性流流感感，世界性大流行世界性大流行丙型丙型流感流感以散在形式出现，以散在形式出现，主要侵袭婴幼儿，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流行。一般不引起流行。乙型乙型流感流感只只会会感感染染人人类类和和海豹海豹有有限限的的宿宿主主导导致致不不会会发发生生重重大大突突变变，呈局限性流行呈局限性流行NPNP（核蛋白）和（核蛋白）和MPMP基质蛋白基质蛋白(M1)(M1)抗原性稳定，具有型特异性，抗原性稳定，具有型特异性，将流感将流感分分 A A（甲）、（甲）、B B（乙）、（乙）、c c（丙）三型（丙）三型甲乙型流感主要亚型甲乙型流感主要亚型血凝素血凝素(HA)(HA)和神经氨酸酶和神经氨酸酶(NA)(NA)抗原结构极易发生变异，有亚抗原结构极易发生变异，有亚型的特异性型的特异性，是甲型流感病毒分亚型的主要依据，是甲型流感病毒分亚型的主要依据,甲型流感甲型流感命命名通常会遵照名通常会遵照 HN HN的规则命名，的规则命名，H H代表血凝素，可分为代表血凝素，可分为1616个亚个亚型；型；N N代表神经氨酸酶，有代表神经氨酸酶，有9 9个亚型。会季节性在人群中出现个亚型。会季节性在人群中出现的亚型通常为的亚型通常为H1H1，2 2和和3 3，以及，以及N1N1和和2 2 根据乙型流感病毒表面血凝素蛋白的抗原特征主要分为根据乙型流感病毒表面血凝素蛋白的抗原特征主要分为B B型型(Yamagata)(Yamagata)和和B B型型(Victoria).(Victoria).根据国家流感中心报道，今年监测到的流感病毒以甲型根据国家流感中心报道，今年监测到的流感病毒以甲型H1N1H1N1亚亚型和乙型（型和乙型（YamagataYamagata）系为主，并且总体上甲型）系为主，并且总体上甲型H1N1H1N1亚型的比亚型的比例超过例超过B B（YamagataYamagata）系。甲型）系。甲型H3N2H3N2亚型和亚型和B B（VictoriaVictoria）系以）系以低水平共同流行。低水平共同流行。我国流感流行现状及亚型我国流感流行现状及亚型不仅在中国，在欧洲一些国家和地区，今冬流行的流感病毒优不仅在中国，在欧洲一些国家和地区，今冬流行的流感病毒优势毒株是势毒株是B B型（型（YamagataYamagata），这一毒株沉寂已久，普通人群对），这一毒株沉寂已久，普通人群对它的免疫基本缺失它的免疫基本缺失图图.中国流感病毒检出率及其亚型分布中国流感病毒检出率及其亚型分布流感的季节性流行流感的季节性流行冬春季冬春季夏季夏季冬春季冬春季长江以南长江以南长江以北长江以北流感病毒在我国的活动规律流感病毒在我国的活动规律南北南北存在明显的差异存在明显的差异。高高峰期峰期1.1.流感患者流感患者2.2.隐性感染者隐性感染者1.1.近距离飞沫传近距离飞沫传播播2.2.接触传播接触传播流感的流行病学流感的流行病学传染源传染源传播途径传播途径病毒变异快病毒变异快6565岁以上老年人、岁以上老年人、婴幼儿、婴幼儿、慢性病患者慢性病患者反复感染反复感染并发症并发症感染流感的一般临床表现：感染流感的一般临床表现：流流感感一一般般急急性性起起病病，主主要要表表现现为为发发热热(可可达达39-40)39-40)，伴伴畏畏寒寒、寒寒战战、头头痛痛、肌肌肉肉关关节节酸酸痛痛、极极度度乏乏力力、食食欲欲减减退退等等全全身身症症状状，常常有有咽咽痛痛、咳咳嗽嗽，可可有有鼻鼻塞塞、流涕，也可有呕吐、腹泻等症状。流涕，也可有呕吐、腹泻等症状。一般来讲，流感全身症状比普通感冒重。流感为自一般来讲，流感全身症状比普通感冒重。流感为自限性疾病，发病限性疾病，发病3-43-4天后体温逐渐消退，全身症状天后体温逐渐消退，全身症状好转。重症病例可导致慢性基础病加重，也可出现好转。重症病例可导致慢性基础病加重，也可出现病毒性肺炎、心脏和神经系统损伤等并发症。病毒性肺炎、心脏和神经系统损伤等并发症。流感病毒的实验室检测流感病毒的实验室检测2流感病毒的实验室检测流感病毒的实验室检测采集标本类型：采集标本类型：常规特殊常规特殊咽拭子咽拭子 鼻咽鼻咽/呼吸道吸取物呼吸道吸取物鼻拭子鼻拭子 鼻洗液、含漱液鼻洗液、含漱液 血清血清 呼吸道灌洗液呼吸道灌洗液实验前处理实验前处理流感标本采集流感标本采集采集时间：采集时间：病人发病的头病人发病的头3 3天内采集，最好是天内采集，最好是24h24h内内咽拭子采集咽拭子采集咽拭子咽拭子用用灭灭菌菌棉棉签签（最最好好用用聚聚丙丙烯烯纤纤维维头头的的塑塑料料杆杆拭拭子子）擦擦拭拭双双侧侧咽咽扁扁桃桃体体及及咽咽后后壁壁，将将棉棉签签头头部部浸浸入入含含3-4ml3-4ml采采集集液液的的管中，尾部弃去，旋紧管盖。管中，尾部弃去，旋紧管盖。注注意意：采采样样前前1h1h内内不不要要进进食食和和饮饮水水，采采样样液液中中严严禁禁加加入入抗抗生素生素标本的处理和保存标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存，常用的采样标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存，常用的采样液有：液有：PH 7.4-7.6PH 7.4-7.6的的HankHanks s液或液或MEMMEM标本应在标本应在44保存保存2424小时内送至实验室，实验室对收到的标本最小时内送至实验室，实验室对收到的标本最好好24244848小时内进行检测或接种。小时内进行检测或接种。如不能在如不能在48h48h内检测或接种，标本应置于内检测或接种，标本应置于-70-70保存保存实验室生物安全要求实验室生物安全要求01季季节节性性流流感感病病毒毒分分离离鉴鉴定定在在生生物物安安全全级实验室进行。级实验室进行。03用用灭灭活活的的抗抗原原进进行行血血清清学学检检测测时时可可以以在在生物安全生物安全级实验室进行级实验室进行流流感感病病毒毒分分离离鉴鉴定定及及其其它它检检测测过过程程中中所所有有能能够够产产生生感感染染性性气气溶溶胶胶的的过过程程必必须须在在生生物物安安全全级实验室的生物安全柜里操作。级实验室的生物安全柜里操作。0203常见的流感病毒实验室检测方法常见的流感病毒实验室检测方法检测方法检测方法灵敏度灵敏度特异性特异性优点优点缺点缺点分子诊断分子诊断（RT-PCRRT-PCR）高高高高病毒含量低的病毒含量低的标本检出率高，标本检出率高，耗时短耗时短培养法培养法（细胞培养法、（细胞培养法、鸡胚培养法）鸡胚培养法）低低高高在分子生物学在分子生物学问世前，一直问世前，一直是流感实验室是流感实验室诊断的金标准，诊断的金标准，至今仍不可取至今仍不可取代代阳性检出率低，阳性检出率低，漏检率高，耗漏检率高，耗时长，技术要时长，技术要求高求高快速试纸条法快速试纸条法（金标法）（金标法）较低较低较高较高操作简单，耗操作简单，耗时短，不需仪时短，不需仪器设备，适用器设备，适用于快速筛查于快速筛查存在假阴性，存在假阴性，漏检率高，只漏检率高，只能鉴定出流感能鉴定出流感病毒病毒A A、B B型，型，不能进行亚型不能进行亚型鉴定鉴定血清学检测血清学检测（血凝抑制试血凝抑制试验验）高高高高能够鉴定亚型能够鉴定亚型要求急性期和要求急性期和恢复期双份血恢复期双份血清，对于季节清，对于季节性流感仅限于性流感仅限于流行病学调查流行病学调查及回顾性诊断及回顾性诊断季节性流感检测流程季节性流感检测流程临床标本采集临床标本采集接种接种MDCKMDCK细胞细胞接种鸡胚接种鸡胚红细胞凝集抑制试验，鉴定病毒红细胞凝集抑制试验，鉴定病毒红细胞凝集试验红细胞凝集试验流感病毒核酸检测阳性流感病毒核酸检测阳性PCRPCR鉴定鉴定流感病毒亚型的鉴定流感病毒亚型的鉴定3红细胞凝集试验红细胞凝集试验1红细胞凝集抑制试验红细胞凝集抑制试验2流感病毒亚型的鉴定流感病毒亚型的鉴定流感病毒亚型的鉴定流程流感病毒亚型的鉴定流程红细胞凝集试验红细胞凝集试验4 4个凝集单位配制个凝集单位配制“回滴回滴”红细胞凝集抑制试验红细胞凝集抑制试验判定流感病毒型别判定流感病毒型别红细胞凝集试验（红细胞凝集试验（HAHA）lMDCKMDCK细胞或鸡胚收获的标本分离物首先用鸡、豚鼠或人红细胞细胞或鸡胚收获的标本分离物首先用鸡、豚鼠或人红细胞进行红细胞凝集试验（进行红细胞凝集试验（HAHA），确定病毒滴度），确定病毒滴度l 原理：流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白（原理：流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白（HAHA）含有能结合并识）含有能结合并识别红细胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白结构，许多哺乳动物别红细胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白结构，许多哺乳动物和禽的红细胞表面均含有这两种成分。因此流感病毒能与其结和禽的红细胞表面均含有这两种成分。因此流感病毒能与其结合并识别，产生凝集现象。当血清中有特异性抗体与病毒血凝合并识别，产生凝集现象。当血清中有特异性抗体与病毒血凝素结合后，可以抑制凝集现象出现素结合后，可以抑制凝集现象出现红细胞胞鸡火火鸡豚鼠豚鼠人人O型型血血红细胞胞马适用范适用范围流流感感和和禽禽流流感病毒感病毒流流感感和和禽禽流感病毒流感病毒流感病毒流感病毒流感病毒流感病毒禽流感病毒禽流感病毒终浓度度（）（）0.5（1%）0.5（1%）0.75（1.5%）/0.5（1%）0.75（1.5%）/0.5（1%）0.5（1%）孔孔底底部部形形状状U或或V型型U或或V型型U型型U型型U型型孵育孵育时间30min30min45min45min60min细胞胞对照照细胞胞沉沉积成成圆点点状状，倾斜斜时细胞胞向向下下流流成成泪泪滴滴状状细胞胞沉沉积成成圆点点状状，倾斜斜时细胞胞向向下下流流成泪滴成泪滴状状细胞胞沉沉积成成环状状细胞胞沉沉积成成环状状细胞胞沉沉积成成环状状AHBCDEFG100ul病毒液病毒液50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul稀释完病毒液后加入稀释完病毒液后加入50ul50ul红细胞悬液红细胞悬液50ulPBS稀释病稀释病毒毒加入配加入配制好的制好的红细胞红细胞悬液悬液充分混充分混匀，置匀，置室温孵室温孵育育30-30-6060分钟分钟观察记观察记录结果录结果操作简图操作简图病病毒毒原原液液1:21:21:128HA:32HA128 HA:4红细胞凝集试验（红细胞凝集试验（HAHA）结果判读）结果判读HAHA滴度滴度8 8，进行红细胞凝集抑制（，进行红细胞凝集抑制（HIHI）试验；）试验；若传若传1 12 2代后，代后，HAHA滴度仍滴度仍88者，可应用核酸检测方法进者，可应用核酸检测方法进行鉴定行鉴定HAHA滴度滴度860 60 岁、体温在岁、体温在 38.0 38.9 38.0 38.9之间，之间，流感病毒阳性检出率高于其他组；流感病毒阳性检出率高于其他组；参考文献参考文献李珺李珺，刘亚楠刘亚楠，田国保田国保等等.临床实验室流感病毒检测的相关影响因素分析临床实验室流感病毒检测的相关影响因素分析J.J.国际病毒学杂志国际病毒学杂志,20172017，2424（5 5）：）：331-335 ISTIC331-335 ISTIC张杰张杰 ，武晶晶，武晶晶 等等.不同温度和不同放置时间对总不同温度和不同放置时间对总RNARNA提取浓度和纯度的影响提取浓度和纯度的影响J J 实验技术与管理实验技术与管理.2013,11.2013,11-有文献报道：不同的放置时间和温度会影响有文献报道：不同的放置时间和温度会影响RNARNA提取的质提取的质量浓度，但对量浓度，但对RNARNA纯度和完整性无明显影响。纯度和完整性无明显影响。建议建议关于如何提高我院流感检出率关于如何提高我院流感检出率B未检测送检标本应在未检测送检标本应在4 4保存，防止保存，防止RNARNA降解降解C金标法阴性的可疑流感病人，建议医生进一金标法阴性的可疑流感病人，建议医生进一步选择灵敏度更高的核酸检测，以防漏检步选择灵敏度更高的核酸检测，以防漏检D对于高危人群，应在发病后尽早采样，必要对于高危人群，应在发病后尽早采样，必要时可采用多部位、多次取样检测时可采用多部位、多次取样检测,以提高以提高流流感病毒阳性检出率感病毒阳性检出率A组织培训，规范取材，保证送检标本质量组织培训，规范取材，保证送检标本质量THANKS