《DNA克隆技术》.ppt
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1、 DNA克隆技术克隆技术许丽辉许丽辉 目目 录录1精选课件目目 录录一、概述一、概述(一)基本概念(一)基本概念 1 克隆克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为获取同一拷贝的过程称为克隆化克隆化(cloning),即即无性繁殖无性繁殖。2 动物克隆动物克隆3 杂交杂交2精选课件目目 录录克隆羊:克隆羊:个体水平个体水平细胞克隆:细胞克隆:细胞水平细胞水平DNA克隆:克隆:分子水平分子水平3精选课件目目 录录卵细胞C母绵羊子宫母绵羊母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植胚胎移植早期胚胎多莉羊分娩卵裂融合后的卵细胞细胞拆合技术
2、妊娠4精选课件目目 录录 4 4 重组重组:不同的DNA分子间发生共价连接形成重组DNA 分子。重组重组DNADNA质粒质粒DNADNA基因片段基因片段5精选课件目目 录录6精选课件目目 录录5 DNA克隆克隆应应用用酶酶学学的的方方法法,在在体体外外将将各各种种来来源源的的遗遗传传物物质质(同同源源的的或或异异源源的的、原原核核的的或或真真核核的的、天天然然的的或或人人工工的的DNA)与与载载体体DNA接接合合成成一一具具有有自自我我复复制制能能力力的的DNA分分子子复复制制子子(replicon),继继而而通通过过转转化化或或转转染染宿宿主主细细胞胞,筛筛选选出出含含有有目目的的基基因因的
3、的转转化化子子细细胞胞,再再进进行行扩扩增增提提取取获获得得大大量量同同一一DNA分分 子子,也也 称称 基基 因因 克克 隆隆 或或 重重 组组 DNA(recombinant DNA)。7精选课件目目 录录生物技术工程生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等酶工程、细胞工程等目的目的 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物(蛋白质)获得感兴趣基因的表达产物(蛋白质)6 基因工程基因工程(genetic engineering)实现实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程,基因克隆所用的方法及相关的工作称基
4、因工程,又称又称重组重组DNA工艺学工艺学。8精选课件目目 录录人体生长激素释放激素(SS)抑制和调节多种激素的作用从动物脑中提取:5mg-5050万只羊脑万只羊脑基因工程9 9升大肠杆菌升大肠杆菌 培养液9精选课件目目 录录10精选课件目目 录录(二)重组(二)重组DNA技术的发展史技术的发展史1865年年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验的豌豆杂交试验1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验的肺炎球菌转化实验1973年年 美国斯坦福大学的科学家构建美国斯坦福大学的科学家构建第一个第一个重组重组DNA分子分子1977年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上美国南旧金山由博耶和斯
5、旺森建立世界上第一家第一家遗传工遗传工程公司,专门应用重组程公司,专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。技术制造医学上重要的药物。1980年年 开始建造开始建造第一家第一家应用重组应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂技术生产胰岛素的工厂1997年年 英国罗林研究所成功的克隆了英国罗林研究所成功的克隆了多莉多莉11精选课件目目 录录19721972年年,P.Berg:,P.Berg:构建第一个构建第一个DNADNA重组分子重组分子19971997年年,动物克隆动物克隆:克隆羊多莉克隆羊多莉19771977年,基因工程产品的出现年,基因工程产品的出现 H.W.BoyerH.W.BoyerH.W
6、.BoyerH.W.Boyer,第一个基因工程产品第一个基因工程产品第一个基因工程产品第一个基因工程产品(SS)(SS)(SS)(SS)19731973年年,S.S.CohenS.S.Cohen:第一个基因克隆实验第一个基因克隆实验 2001年,人类基因组计划年,人类基因组计划12精选课件目目 录录 重组重组DNA医药产品医药产品目目 录录13精选课件目目 录录(三)重组(三)重组DNA技术技术路线技术技术路线目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体菌导入受体菌外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达
7、 14精选课件目目 录录二、重组二、重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶15精选课件目目 录录(一)限制性核酸内切酶(一)限制性核酸内切酶1 核酸酶的分类核酸酶的分类2 限限 制制 性性 核核 酸酸 内内 切切 酶酶(restriction endonuclease,RE)是是识识别别DNA的的特特异异序序列列,并并在在识识别位点或其周围切割双链别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H16精选课件目目 录录第一个字母取自产生该酶的细菌属名,用大写;第一个字母取自产生该酶的细菌属名,用大写;第二、第三个字母是
8、该细菌的种名,用小写;第二、第三个字母是该细菌的种名,用小写;第四个字母代表株;第四个字母代表株;用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。3 命名命名Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶17精选课件目目 录录5共性共性 (1)只作用于双链)只作用于双链DNA (2)活性有赖于)活性有赖于Mg2+(3)碱基识别特异性)碱基识别特异性 (4)切口形式)切口形式6 使用原则及注意事项使用原则及注意事项 4 分类分类、(基因工程技术中常用(基因工程技术中常用型)型)18精选课件目目
9、录录类酶识别序列特点类酶识别序列特点 回文结构回文结构(palindrome)切口切口 :平端切口平端切口、粘端切口粘端切口GGGGA AT TCCCCCCCCT TA AGGGG19精选课件目目 录录Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口粘端切口粘端切口20精选课件目目 录录n(二)大肠杆菌(二)大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶n(三)(三)T4噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶n(四)(四)TaqDNA聚合酶聚合酶n(五)反转录酶(五)反转录酶n(六)连接酶(六)连接酶n(七)末端(脱氧核苷酸)转移酶(
10、七)末端(脱氧核苷酸)转移酶n(八)碱性磷酸酶(八)碱性磷酸酶21精选课件目目 录录 三三 目的基因及载体的分离目的基因及载体的分离(一)目的基因的获取(一)目的基因的获取 直接从染色体直接从染色体DNADNA中分离中分离 人工合成人工合成 1.601.60元元/碱基碱基 基因文库基因文库 反转录反转录PCR PCR mRNA cDNAmRNA cDNA PCR PCR 直接索取直接索取分分分22精选课件目目 录录 (二)(二)基因载体基因载体定义定义能携带目的基因进入宿主细胞并且在能携带目的基因进入宿主细胞并且在宿主细胞中进行扩增和表达的一类宿主细胞中进行扩增和表达的一类DNA分分子。子。1
11、 载体的种类载体的种类质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA23精选课件目目 录录(1 1)质粒)质粒(plasmid)特点特点 能能在在宿宿主主细细胞胞内内独独立立自自主主复复制制;带带有有某某些遗传信息些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。24精选课件目目 录录噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列(插入型,适用系列(插入型,适用cDNA克隆)克隆)EMBL系列(置换型,适用基因组克隆)系列(置换型,适用基因组克隆)(2)噬菌体)噬菌体(phage)M13噬菌体噬菌体DNA改造系统(含改造系统(含lacZ基因)基因)M13mp系列系列pUC系列系
12、列25精选课件目目 录录n(3)病毒载体)病毒载体n(4)粘性质粒)粘性质粒26精选课件目目 录录2 载体的条件载体的条件n有扩增所需的复制起始点,即能自主复制;有扩增所需的复制起始点,即能自主复制;n有多克隆位点(外源有多克隆位点(外源DNA插入点),常具有插入点),常具有多个单一酶切位点;多个单一酶切位点;n具有两个以上的遗传标记物,便于重组体的具有两个以上的遗传标记物,便于重组体的筛选和鉴定;筛选和鉴定;n表达型载体必须具有指导基因表达的调控元表达型载体必须具有指导基因表达的调控元件。件。27精选课件目目 录录多克隆位点多克隆位点ori复制起始点复制起始点遗传标记遗传标记A Ammp p
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