DB21∕T 2451-2015 玉米品种真实性鉴定 SSR分子检测方法.pdf
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1、ICS 65.020.20 B 21 DB21 辽宁省地方标准 DB 21/T 24512015 玉米品种真实性鉴定 SSR 分子检测方法 Maize variety genuineness verification with SSR markers 2015 - 04 - 01 发布 2015 - 06 - 01 实施 辽宁省质量技术监督局 发 布 DB21/T 24512015 I 目 次 前言. II 1 范围. 1 2 规范性引用文件. 1 3 术语、定义和缩略语. 1 4 方法原理. 2 5 仪器设备、试剂和溶液配制. 2 6 检测步骤. 3 7 结果分析和表示. 6 8 结果判定.
2、 6 附录 A(规范性附录) 核心引物名称和序列 . 7 附录 B(规范性附录) 溶液配制 . 9 DB21/T 24512015 II 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由辽宁省农村经济委员会提出并归口。 本标准起草单位:辽宁省种子管理局。 本标准起草人:朱志成、李波、高振环、邹畅、肖国峰、王汝宝、李洪建、赵前程、王见中、温浩、李鹏、史鸿儒、安辉、徐策、孙丽红、王东坡。 DB21/T 24512015 1 玉米品种真实性鉴定 SSR 分子检测方法 1 范围 本标准规定了玉米品种真实性鉴定的原理、仪器设备、检测步骤及结果判定。 本标准适用于玉米品种真实性 SS
3、R 分子鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1.1 品种真实性 供检样品与该品种的对照样品是否相符。 3.1.2 对照样品 省级以上种子管理部门收集并保存的与品种名称相符的种子样品。 3.1.3 参照品种 已知等位变异 SSR 位点的品种。 3.1.4 SSR 分子检测
4、 通过 SSR 分子标记检测玉米品种基因组 DNA 的差异,鉴定玉米品种真实性的检测方法。 3.2 缩略语 DB21/T 24512015 2 CTAB:cetyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵。 DNA:deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸。 dNTPs:deoxyribonucleoside triphosphates,脱氧核苷三磷酸。 PAGE:polyacrylamide gel electrophoresis,聚丙烯酰胺凝胶电泳。 PCR:polymerase chain reaction,聚合酶链式反应。 SDS:sod
5、ium dodecyl sulfate,十二烷基苯磺酸钠。 SSR:simple sequence repeat,简单重复序列。 Taq酶:Taq- DNA polymerase,耐热DNA聚合酶。 4 方法原理 由于不同玉米品种遗传组成不同,基因组 DNA 中简单重复序列的重复次数存在差异,这种差异可通过 PCR 扩增及电泳方法进行检测,从而能够鉴定玉米品种真实性。 5 仪器设备、试剂和溶液配制 5.1 仪器设备 5.1.1 PAGE 检测平台 高速冷冻离心机、水浴锅、紫外分光光度计、PCR 扩增仪、微量移液器、电子天平、高压灭菌锅、磁力搅拌器、微波炉、冰箱、高压电泳仪、垂直电泳槽及制胶附件
6、、水平摇床、胶片观察灯、凝胶成像系统或数码相机。 5.1.2 毛细管电泳检测平台 高速冷冻离心机、水浴锅、紫外分光光度计、PCR 扩增仪、微量移液器、电子天平、高压灭菌锅、磁力搅拌器、微波炉、冰箱、DNA 分析仪。 5.2 试剂 5.2.1 PAGE 电泳 CTAB、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na22H2O)、三羟甲基氨基甲烷(Tris-base)、37%的盐酸、氢氧化钠(NaOH)、氯化钠(NaCl)、dNTPs、Taq 酶、10Buffer 缓冲液、矿物油、去离子甲酰胺(Formamide)、溴酚蓝(Brph Blue)、二甲苯青 FF、甲叉双丙烯酰胺(bisa
7、crylamide) 、 丙烯酰胺 (acrylamide) 、 硼酸 (Boric Acid) 、 尿素、 亲和硅烷 (Binding Silane) 、疏水硅烷(Repel Silane)、DNA 分子量标准、无水乙醇、四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸铵(APS)、冰醋酸、乙酸铵、硝酸银、甲醛。 5.2.2 毛细管电泳 CTAB、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na22H2O)、三羟甲基氨基甲烷(Tris-base)、37%的盐酸、氢氧化钠(NaOH)、氯化钠(NaCl)、dNTPs、Taq酶、10Buffer缓冲液、矿物油、DNA分析仪专用丙烯酰胺胶、DNA分析仪
8、专用分子量内标、DNA分析仪专用电泳缓冲液。 5.3 溶液配制 DB21/T 24512015 3 DNA提取、PCR扩增、电泳以及银染溶液按照附录B(规范性附录)规定的要求进行配制,所用试剂均为分析纯。 试剂配制所用水应符合GB/T 6682规定的一级水的要求,其中银染溶液的配制只需达到三级水的要求。 6 检测步骤 6.1 送验样品及 DNA 提取 6.1.1 送验样品 送验样品为种子,重量不低于 200g 或不少于 500 粒。送验样品为果穗,应不低于 5 个果穗(总粒数不低于 500 粒);送验样品为幼苗、叶片或苞叶的,应至少含有 40 个个体。 对于玉米自交系或单交种,可采用混合样或单
9、个个体独立检测。混合样的试样应至少含有 20 个个体,单个个体独立检测的试样应至少含有 5 个个体。采用混合样而检测结果在某个引物位点出现异质性并影响到结果判定的,应采用单个个体独立检测,试样应至少含有 20 个个体。 6.1.2 DNA 提取 DNA提取方法可任选6.1.2.1至6.1.2.4所列的一种方法。 DNA质量应符合PCR扩增的要求。 6.1.2.1 CTAB 法 取试样的幼苗或叶片 200mg300 mg 置于 2.0 mL 离心管,加液氮充分研磨,或取种子充分磨碎后,移入 2.0 mL 离心管。每管加入 700 L 经 65预热的 CTAB 提取液,充分混匀,65水浴 60mi
10、n 充分混匀。每管加入等体积的三氯甲烷/异戊醇(24:1)混合液,充分混合后静置 10min,在 12000rpm 条件下离心 15 min。吸取上清液转移至另一离心管内,加入等体积预冷的异丙醇,充分混匀,-20放置 30 min后在 4、12000 rpm 条件下离心 10min,弃上清液,加入 70%乙醇溶液,旋转 2 次后弃去乙醇溶液,并倒立于垫有滤纸的实验台上,室温放置 10 min 以上。加入 100 L 超纯水或 TE 缓冲液 1,充分溶解后备用。 此方法为 DAN 提取的仲裁方法。 6.1.2.2 SDS 法 剪取试样的幼苗或叶片或剥取干种子的胚,置于 1.5 mL 离心管,加入
11、 100 L 氯仿后研磨,再加入300L SDS 提取液,混匀后在 10000rpm 条件下离心 2min。吸取上清液,转移至预先装有 300L 异丙醇和 300L 5mol/L 氯化钠溶液的 1.5mL 离心管中。 待成团后, 挑出 DNA, 经 70%乙醇溶液洗涤后, 加入 200L TE 缓冲液 1,充分溶解后备用。 6.1.2.3 碱煮法 剥取试样干种子的胚, 或将种子培养至幼苗长度达到 3cm 左右时剪取每株幼苗 1.5cm, 放入 96 孔深孔板中。每孔加入 150L 氢氧化钠溶液,煮沸 5min,然后加入 150L TE 缓冲液 2,充分溶解后备用。 6.1.2.4 试剂盒法 选
12、用适宜SSR标记法的商业试剂盒,并经验证合格后使用。提取方法,按照提供的使用说明进行。 DB21/T 24512015 4 6.2 PCR 扩增 6.2.1 反应体系 PCR 扩增反应体系的总体积可以依据具体情况确定。20L 反应体系应符合表 1 的要求。 本标准推荐了 40 对核心引物,引物名称和序列见附录 A。选用 PAGE 电泳,应合成普通引物,采用单引物电泳。选用毛细管电泳,合成引物时需在上游引物的 5端标记荧光染料,可采用单引物电泳或多引物组合电泳。 对于近似品种,采用本标准推荐 40 对核心引物无明显差异的,可以采用能够区分的特异引物作为进行 SSR 检测。当使用特异引物时,应在检
13、验报告中说明该特异引物的序列信息。 表1 PCR 扩增反应体系 反 应 组 分 原 浓 度 终 浓 度 体 积 ( L) ddH2O 12.35 10Buffer 10 1 2 MgCl2 25 mmol/ L 2.5 mmol/L 2 dNTP 2.5 mmol/ L each 0.15 mmol/ L each 1.2 Taq 酶 5 U/ L 1 U 0.2 引 物 20mol/ L 0.25 mol/ L each 0.25 DNA 25ng/ L 2.5ng/ L 2 6.2.2 反应程序 反应采用下列程序:94预变性5min,1次循环;94变性40s,60退火35s,72延伸45s
14、,进行35次循环扩增反应;72延伸10min。反应程序的反应参数可根据PCR扩增仪型号、酶、引物等不同而进行适当的调整。形成的扩增产物于4保存。 6.3 扩增产物检测 6.3.1 PAGE 电泳 6.3.1.1 制胶 制胶执行下列程序: a) 蘸洗涤灵用清水将玻璃板反复擦洗干净,再用双蒸水、95%乙醇溶液分别擦洗两遍。玻璃板干燥后,将0.5 mL亲和硅烷工作液,均匀涂在无凹槽的玻璃板上;将0.5 mL疏水硅烷工作液,均匀涂在带凹槽的玻璃板上。操作过程中两块玻璃板分别处理,防止相互污染; b) 玻璃板彻底干燥后,将塑料隔条整齐放在无凹槽玻璃板两侧,盖上凹槽玻璃板,夹子固定后,用水平仪检测玻璃胶室
15、是否水平; c) 取100mL 4.5%PAGE胶,加入TEMED、25%过硫酸铵各100L,迅速混匀,将胶灌入玻璃胶室,灌胶过程应防止气泡的出现。 待胶室灌满后, 在凹槽处将鲨鱼齿朝外轻轻插入样品梳, 在室温下聚合1h以上。 6.3.1.2 变性 DB21/T 24512015 5 取20l扩增产物(见6.2.2),加入4 L 6加样缓冲液,混匀。在PCR扩增仪上运行94变性5 min,4冷却10 min后备用。 6.3.1.3 电泳 电泳执行下列程序: a) 正极槽 (下槽) 加入1TBE缓冲液600mL, 负极槽 (上槽) 加入经65预热的1TBE缓冲液600mL,拔出样品梳,在90W恒
16、功率下预电泳10min20min; b) 用移液器清除加样槽孔气泡和杂质,插入样品梳(鲨鱼齿朝下),每一个加样孔点入5L样品(6.3.1.2),在80W恒功率下电泳; c) 电泳时间因扩增产物预期片段大小不同而有所不同,一般来说,DNA扩增产物的预期片段,泳动到胶板中部位置,效果较好,可采用上部的二甲苯青指示带进行确定; d) 达到电泳时间后关闭电源,结束电泳,取下玻璃板并轻轻撬开,通常凝胶附着在无凹槽的玻璃板上。 6.3.1.4 染色 染色执行下列程序: a) 将附着凝胶的玻璃板浸入固定液中,轻轻晃动3min后取出,在双蒸水中快速漂洗,时间不超过10 s; b) 将胶板放入染色液中,轻轻晃动
17、5min后取出,在双蒸水中快速漂洗,时间不超过10s; c) 将胶板放入显影液中,轻轻晃动待条带清晰后取出,再迅速放入固定液中定影5min取出,在双蒸水中漂洗1min; d) 取出胶板,晾干,放在胶片观察灯上观察,记录结果,拍照保存。 注:固定液、染色液、双蒸水和显影液的用量,可依据胶板数量和大小调整,以浸过胶面为准。 6.3.1.5 数据记录 供检样品与对照样品在同一电泳板上并排电泳时,每个位点进行逐对比较,并记录比较结果。 供检样品与对照样品DNA指纹库中的指纹数据进行比较时,执行下列程序: a) 将供检样品与参照品种在同一电泳板上并排电泳,逐个位点进行逐对比较,并记录比较结果。 b) 将
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