DNA指纹图谱技术.ppt

loading12%16%18%21%26%42%52%52%63%78%96%100%.DNADNA指纹图谱技术在土壤微生指纹图谱技术在土壤微生物多样性研究中的应用物多样性研究中的应用.以以DNA指纹图谱技术为基指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法础的微生物多样性研究方法主要内容主要内容核糖体核糖体RNA基因的介绍基因的介绍核糖体核糖体RNA基因的介绍基因的介绍一、核糖体一、核糖体RNARNA基因的介绍基因的介绍 目前在微生物分类学及菌种鉴定研究目前在微生物分类学及菌种鉴定研究中最有用和最常用的分子是中最有用和最常用的分子是rRNArRNA，rRNArRNA约占细约占细胞中胞中RNARNA总量的总量的75%80%75%80%。真核生物：真核生物：5S5S、5.8S5.8S、18S18S、28S28S四种四种rRNArRNA基因基因原核生物：原核生物：5S5S、16S16S、23S23S三种三种rRNArRNA基因基因 其中其中16S16S、18S rRNA18S rRNA基因大小适中，基因大小适中，不但含有高度保守的基因片段，而且在不同的不但含有高度保守的基因片段，而且在不同的菌株间也含有变异的核酸片段，因此其应用最菌株间也含有变异的核酸片段，因此其应用最为普遍。为普遍。一、一、核糖体核糖体RNARNA基因的介绍基因的介绍 分析时可利用恒定区序列设计引物，分析时可利用恒定区序列设计引物，将将16S rDNA16S rDNA进行进行PCR PCR 扩增，产生长度相同但扩增，产生长度相同但序列有异的序列有异的DNADNA片段混合物，然后利用可变区片段混合物，然后利用可变区序列的差异对不同菌属、菌种的细菌进行分序列的差异对不同菌属、菌种的细菌进行分离。离。由于由于16S rDNA16S rDNA及及18S rDNA18S rDNA的序列，的序列，每年都以很快的速度补充到每年都以很快的速度补充到GenBankGenBank中去，这中去，这使得能够比较方便地利用这一数据库进行微使得能够比较方便地利用这一数据库进行微生物群体多样性的研究。生物群体多样性的研究。利用利用rDNArDNA测量细菌进化和亲缘关系测量细菌进化和亲缘关系一、一、核糖体核糖体RNARNA基因的介绍基因的介绍首先，首先，16S rDNA 普遍存在于原核生物中普遍存在于原核生物中，参，参与生物蛋白质的合成过程，并在生物进化的漫与生物蛋白质的合成过程，并在生物进化的漫长历程中保持不变，是生物演变的时间钟。长历程中保持不变，是生物演变的时间钟。其次，在其次，在 16S rDNA 分子中，既分子中，既含有高度保守含有高度保守区域，又有中度保守和高度变化的区域区域，又有中度保守和高度变化的区域，适用，适用于进化距离不同的各类细菌亲缘关系的研究。于进化距离不同的各类细菌亲缘关系的研究。第三，第三，16S rDNA 的相对分子量的相对分子量大小适中大小适中，约，约 1 540 个核苷酸，便于序列分析。个核苷酸，便于序列分析。利用利用rDNArDNA测量细菌进化和亲缘关系测量细菌进化和亲缘关系利用利用rRNA rRNA 基因序列研究微生物多样性可采用基因序列研究微生物多样性可采用不同的策略，目前一般常用以下几种方法：不同的策略，目前一般常用以下几种方法：二、以二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法1 1、变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳、变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳2 2、单链构象多态性、单链构象多态性3 3、限制性片段长度多态性、限制性片段长度多态性4 4、末端限制性片段长度多态性、末端限制性片段长度多态性5 5、随机引物扩增多态性、随机引物扩增多态性 6 6、扩增、扩增rDNArDNA限制性酶切片段分析限制性酶切片段分析。变性梯度凝胶电泳（变性梯度凝胶电泳（DGGEDGGE）和温度梯度凝胶）和温度梯度凝胶电泳（电泳（TGGETGGE）二、以二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法原理原理 在聚丙烯酰胺中加入甲酰胺，从正极在聚丙烯酰胺中加入甲酰胺，从正极到负极梯度递加，或是形成温度梯度，电泳中到负极梯度递加，或是形成温度梯度，电泳中的的DNADNA到达它的变性甲酰胺浓度或温度时，双链到达它的变性甲酰胺浓度或温度时，双链部分解开，造成泳动速度发生变化，从而达到部分解开，造成泳动速度发生变化，从而达到分离效果。分离效果。1 1、变性梯度凝胶电泳（、变性梯度凝胶电泳（DGGEDGGE）和温度梯度凝）和温度梯度凝胶电泳（胶电泳（TGGETGGE）二、以二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法步骤步骤（1 1）样品总）样品总DNADNA提取；提取；（2 2）样品）样品16S16S或或18SrDNA18SrDNA片段的片段的PCRPCR扩增及纯化；扩增及纯化；（3 3）制取变性梯度聚丙烯酰胺凝胶；）制取变性梯度聚丙烯酰胺凝胶；（4 4）染色；）染色；（5 5）样品的）样品的DGGEDGGE分析；分析；（6 6）割胶测序。）割胶测序。DGGE.2 2、单链构象多态性（、单链构象多态性（SSCPSSCP）二、以二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法 不同碱基序列的单链不同碱基序列的单链 DNA DNA 分子构象分子构象不同，不同，DNADNA片段变性成单链后受到凝胶分子筛不片段变性成单链后受到凝胶分子筛不同作用力，最终使不同同作用力，最终使不同DNADNA片段得到分离。电泳片段得到分离。电泳结束后可以将不同的条带切下并测序，或采用结束后可以将不同的条带切下并测序，或采用特异性探针进行杂交，进而显示该特定微生物特异性探针进行杂交，进而显示该特定微生物类群的动态变化。类群的动态变化。3 3、限制性片段长度多态性（、限制性片段长度多态性（RFLPRFLP）二、以二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法 根据不同生物个体或种群之间根据不同生物个体或种群之间DNADNA片片段酶切位点有所差异的特点，利用限制性内切段酶切位点有所差异的特点，利用限制性内切酶进行消化，产生长短、种类、数目不同的限酶进行消化，产生长短、种类、数目不同的限制性片段，然后对这些特定制性片段，然后对这些特定DNADNA片段的限制性内片段的限制性内切酶产物进行分析，根据特定的限制性酶谱图切酶产物进行分析，根据特定的限制性酶谱图可对群落中的微生物加以区分。可对群落中的微生物加以区分。3 3、限制性片段长度多态性（、限制性片段长度多态性（RFLPRFLP）二、以二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法(1)(1)选用选用rDNArDNA的恒定区序列设计引物；的恒定区序列设计引物；(2)(2)选择性扩增选择性扩增rDNArDNA片断；片断；(3)(3)对扩增产物用适当的限制性内切酶对扩增产物用适当的限制性内切酶进行酶切；进行酶切；(4)(4)琼脂凝胶电泳分离产生限制性片断；琼脂凝胶电泳分离产生限制性片断；(5)(5)用所得到的指纹图谱进行分析，根用所得到的指纹图谱进行分析，根据片段的大小以及标记片断种类和数据片段的大小以及标记片断种类和数量的不同，分析群落的结构及组成多量的不同，分析群落的结构及组成多样性。样性。4 4、末端限制性片段长度多态性（、末端限制性片段长度多态性（T-RFLPT-RFLP）二、以二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法此法与此法与RFLPRFLP原理相同，只是在原理相同，只是在PCRPCR引物的一端用荧光染料进引物的一端用荧光染料进行标记，这样使得限制片段长行标记，这样使得限制片段长度多态性图谱更为简化，只需度多态性图谱更为简化，只需检测被标记的末端限制性片段，检测被标记的末端限制性片段，就可以分析复杂群落。就可以分析复杂群落。5 5、随机引物扩增多态性、随机引物扩增多态性 DNADNA（RAPDRAPD）二、以二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法 对整个基因组的对整个基因组的DNADNA分子而言，某一分子而言，某一引物可能会与单链引物可能会与单链DNADNA的许多位点结合，然后对的许多位点结合，然后对扩增产物进行电泳，用溴化乙锭染色，就可以扩增产物进行电泳，用溴化乙锭染色，就可以直接检验出被扩增的直接检验出被扩增的DNADNA多态性。多态性。该技术以随机寡核苷酸作为引物，该技术以随机寡核苷酸作为引物，扩增得到的多态性片段较短，更方便检测两个扩增得到的多态性片段较短，更方便检测两个同源或异源等位基因的有无，适用于种内和亚同源或异源等位基因的有无，适用于种内和亚种更为细致的分类。种更为细致的分类。6 6、扩增、扩增rDNArDNA限制性酶切片段分析（限制性酶切片段分析（ARDRAARDRA）二、以二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法 ARDRA ARDRA 是用特定引物进行是用特定引物进行 rDNArDNA的扩增，的扩增，再对扩增产物进行再对扩增产物进行RFLPRFLP分析，这项技术可以为土壤分析，这项技术可以为土壤细菌群落水平上提供可靠的基因型特征，这项技术细菌群落水平上提供可靠的基因型特征，这项技术常被用来了解各种样品的群落结构。常被用来了解各种样品的群落结构。ARDRAARDRA方法最大的缺点是工作量大，目前，方法最大的缺点是工作量大，目前，应用该方法进行微生物群落结构分析，还没有人设应用该方法进行微生物群落结构分析，还没有人设置重复。置重复。二、以二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法 除此以外，还有除此以外，还有重复基因外回文重复基因外回文序列序列-PCR-PCR、核糖体间隔分析核糖体间隔分析、编码蛋白质编码蛋白质的基因推测的基因推测、质粒指纹图谱分析质粒指纹图谱分析等等现代分现代分子生物学技术研究方法，不需要对微生物子生物学技术研究方法，不需要对微生物进行分离培养，克服了传统微生物培养技进行分离培养，克服了传统微生物培养技术的局限性，能够客观分析，精确解释微术的局限性，能够客观分析，精确解释微生物种类的多样性，给微生物生态学的研生物种类的多样性，给微生物生态学的研究带来了光明前景。究带来了光明前景。