DNA指纹图谱技术.ppt
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1、loading12%16%18%21%26%42%52%52%63%78%96%100%.DNADNA指纹图谱技术在土壤微生指纹图谱技术在土壤微生物多样性研究中的应用物多样性研究中的应用.以以DNA指纹图谱技术为基指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法础的微生物多样性研究方法主要内容主要内容核糖体核糖体RNA基因的介绍基因的介绍核糖体核糖体RNA基因的介绍基因的介绍一、核糖体一、核糖体RNARNA基因的介绍基因的介绍 目前在微生物分类学及菌种鉴定研究目前在微生物分类学及菌种鉴定研究中最有用和最常用的分子是中最有用和最常用的分子是rRNArRNA,rRNArRNA约占细约占细胞中胞中RNARN
2、A总量的总量的75%80%75%80%。真核生物:真核生物:5S5S、5.8S5.8S、18S18S、28S28S四种四种rRNArRNA基因基因原核生物:原核生物:5S5S、16S16S、23S23S三种三种rRNArRNA基因基因 其中其中16S16S、18S rRNA18S rRNA基因大小适中,基因大小适中,不但含有高度保守的基因片段,而且在不同的不但含有高度保守的基因片段,而且在不同的菌株间也含有变异的核酸片段,因此其应用最菌株间也含有变异的核酸片段,因此其应用最为普遍。为普遍。一、一、核糖体核糖体RNARNA基因的介绍基因的介绍 分析时可利用恒定区序列设计引物,分析时可利用恒定区序
3、列设计引物,将将16S rDNA16S rDNA进行进行PCR PCR 扩增,产生长度相同但扩增,产生长度相同但序列有异的序列有异的DNADNA片段混合物,然后利用可变区片段混合物,然后利用可变区序列的差异对不同菌属、菌种的细菌进行分序列的差异对不同菌属、菌种的细菌进行分离。离。由于由于16S rDNA16S rDNA及及18S rDNA18S rDNA的序列,的序列,每年都以很快的速度补充到每年都以很快的速度补充到GenBankGenBank中去,这中去,这使得能够比较方便地利用这一数据库进行微使得能够比较方便地利用这一数据库进行微生物群体多样性的研究。生物群体多样性的研究。利用利用rDNA
4、rDNA测量细菌进化和亲缘关系测量细菌进化和亲缘关系一、一、核糖体核糖体RNARNA基因的介绍基因的介绍首先,首先,16S rDNA 普遍存在于原核生物中普遍存在于原核生物中,参,参与生物蛋白质的合成过程,并在生物进化的漫与生物蛋白质的合成过程,并在生物进化的漫长历程中保持不变,是生物演变的时间钟。长历程中保持不变,是生物演变的时间钟。其次,在其次,在 16S rDNA 分子中,既分子中,既含有高度保守含有高度保守区域,又有中度保守和高度变化的区域区域,又有中度保守和高度变化的区域,适用,适用于进化距离不同的各类细菌亲缘关系的研究。于进化距离不同的各类细菌亲缘关系的研究。第三,第三,16S r
5、DNA 的相对分子量的相对分子量大小适中大小适中,约,约 1 540 个核苷酸,便于序列分析。个核苷酸,便于序列分析。利用利用rDNArDNA测量细菌进化和亲缘关系测量细菌进化和亲缘关系利用利用rRNA rRNA 基因序列研究微生物多样性可采用基因序列研究微生物多样性可采用不同的策略,目前一般常用以下几种方法:不同的策略,目前一般常用以下几种方法:二、以二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法1 1、变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳、变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳2 2、单链构象多态性、单链构象多态性3 3、限制性片段长度多态性、限制性
6、片段长度多态性4 4、末端限制性片段长度多态性、末端限制性片段长度多态性5 5、随机引物扩增多态性、随机引物扩增多态性 6 6、扩增、扩增rDNArDNA限制性酶切片段分析限制性酶切片段分析。变性梯度凝胶电泳(变性梯度凝胶电泳(DGGEDGGE)和温度梯度凝胶)和温度梯度凝胶电泳(电泳(TGGETGGE)二、以二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法原理原理 在聚丙烯酰胺中加入甲酰胺,从正极在聚丙烯酰胺中加入甲酰胺,从正极到负极梯度递加,或是形成温度梯度,电泳中到负极梯度递加,或是形成温度梯度,电泳中的的DNADNA到达它的变性甲酰胺浓度或温
7、度时,双链到达它的变性甲酰胺浓度或温度时,双链部分解开,造成泳动速度发生变化,从而达到部分解开,造成泳动速度发生变化,从而达到分离效果。分离效果。1 1、变性梯度凝胶电泳(、变性梯度凝胶电泳(DGGEDGGE)和温度梯度凝)和温度梯度凝胶电泳(胶电泳(TGGETGGE)二、以二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法步骤步骤(1 1)样品总)样品总DNADNA提取;提取;(2 2)样品)样品16S16S或或18SrDNA18SrDNA片段的片段的PCRPCR扩增及纯化;扩增及纯化;(3 3)制取变性梯度聚丙烯酰胺凝胶;)制取变性梯度聚丙烯酰胺凝
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