流式细胞仪结果分析报告模板.ppt
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1、 郝圆园 201731830流式细胞仪分析技术及流式细胞仪分析技术及应用应用.流式细胞术流式细胞术(flow cytometry,FCM)是以流式细胞仪为检测手段的是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。和分选的新技术。流式细胞术流式细胞术.流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下,细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下,通过荧光探针的协助,从分子水平上获取多种通过荧光探针的协助,从分子水平上获取多种信号对细胞进
2、行定量分析或纯化分选。信号对细胞进行定量分析或纯化分选。特点:检测速度快、检测通量高、单细胞多参数的检测特点:检测速度快、检测通量高、单细胞多参数的检测流式细胞术的特点流式细胞术的特点.流式细胞仪流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪,是在单个细胞分析和分选基础上发展起来分析仪,是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质(如大小、内部结构、的对细胞的物理或化学性质(如大小、内部结构、DNADNA、RNARNA、蛋白质、抗原等)进行快速测量并可分、蛋白质、抗原等)进行快速测量并可分类收集的高技术。类收集的高技术。流式流式细胞仪流式细
3、胞仪仪流式细胞仪流式细胞仪流式细胞仪.样本来源:样本来源:各种细胞(如外周血,骨髓,实体组织、悬浮或贴壁培养的细胞),微生物,人工合成微球等。检测大小:检测大小:一般是0.5um40um流式细胞仪可以做什么?流式细胞仪可以做什么?.液流系统液流系统光学系统光学系统数据处理系统数据处理系统 分析型流式细胞仪分析型流式细胞仪分选系统分选系统分选型流式细胞仪分选型流式细胞仪流式细胞仪的组成流式细胞仪的组成.(1)液流 液流系统液流系统流动室流动室流动室(流动室(Flow cell)是液流系统的核心部件,流动室是由石英玻璃制成,单细胞悬液在流动室里被鞘液流包绕通过流动室内一定孔径的孔,检测区在该孔的中
4、心,细胞在此与激光垂直相交。.层流水力聚焦技术层流水力聚焦技术.光学系统光学系统Light scattering at FSC represents the particle size and areaLight scattering at SSC depends on granularity and complexity of the particle.激光光源:气冷式氩离子激光器激光光源:气冷式氩离子激光器分色反光镜:反射长分色反光镜:反射长/短波长,通过短短波长,通过短/长波长长波长光束成形器:两十字交叉放置的透镜光束成形器:两十字交叉放置的透镜透镜组:形成平行光,除去室内光透镜组:形成
5、平行光,除去室内光滤片:长通、短通、带通滤片:长通、短通、带通光电倍增管:光电倍增管:FS,SSFS,SS(散射光),(散射光),FL1,FL2,FL3,FL4FL1,FL2,FL3,FL4(荧光)(荧光)光学系统光学系统.FlowFlowTipTipLaserLaserSS and FLSS and FLDetectorDetectorFS DetectorFS Detector光学系统示意图光学系统示意图.主要由计算机及其软件组成主要由计算机及其软件组成(3)数据处理系统.基本工作原理基本工作原理.单细胞液柱已标记的单细胞悬液和鞘液硅化管流动室喷嘴荧光检测系统和散射光感受系统收集光信号荧光
6、染料被激发发光光电倍增管脉冲信号计算机系统分析结果放大垂直相交形成稳态水平激光与之基本过程基本过程.细胞在液柱中与激光束相交时细胞在液柱中与激光束相交时向周围向周围360立体角方向散射的光线立体角方向散射的光线信号,它的强弱与细胞的大小、形信号,它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关,主要分状、胞内颗粒折射等有关,主要分为为前向散射光前向散射光和侧向散射光侧向散射光。二、散射光的测定二、散射光的测定.前向散射光前向散射光(forward scatter,forward scatter,FSFS):激光束照射细胞时,光以激光束照射细胞时,光以相对轴较小角度相对轴较小角度(0.5(0.51
7、0)10)向前方散射的讯号用于检测细胞等向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性,信号强弱与细胞体积大小成正比粒子的表面属性,信号强弱与细胞体积大小成正比。.FALS SensorLaser前向散射光示意图前向散射光示意图.侧向散射光(side scatter,SS):激光束照射细胞时,光以90角散射的讯号,用于检测细胞内部结构属性。.FALS Sensor90LS SensorLaser侧向散射光侧向散射光示意图示意图.测得的测得的FSFS与与SSSS信信号通过计算机处理,号通过计算机处理,可得到可得到FS-SSFS-SS图,由此图,由此可仅用散射光信号对可仅用散射光信号对未染色的活细胞
8、进行未染色的活细胞进行分析或分选。分析或分选。此为血细胞分类此为血细胞分类的基本原理,但不能的基本原理,但不能分析表面分子。分析表面分子。淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞中性粒细胞中性粒细胞光散射测量最有效用途:光散射测量最有效用途:从非均一群体中鉴别出某些亚群从非均一群体中鉴别出某些亚群.荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生,发射的荧光波长与激发光波长不同。后产生,发射的荧光波长与激发光波长不同。每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色,通过波每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色,通过波长选择通透性滤片,可将不同波长的散射光和荧光
9、信长选择通透性滤片,可将不同波长的散射光和荧光信号区分开,送入不同的光电倍增管。号区分开,送入不同的光电倍增管。选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。个不同特征。线性放大器和对数放大器线性放大器和对数放大器三、荧光测量三、荧光测量.荧光染料的特性荧光染料的特性激发波长激发波长(EXCITING)(EXCITING)发射波长发射波长(EMISSION)(EMISSION).荧光补偿荧光补偿.通过流式细胞仪进行细胞分选主通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。一
10、步培养和研究时进行的。四、细胞分选原理四、细胞分选原理.细胞悬液形成液流柱细胞悬液形成液流柱流动室振动流动室振动液流断裂成液滴液流断裂成液滴空白液滴空白液滴含细胞的液滴含细胞的液滴弃去弃去偏转落入收集器偏转落入收集器压电晶体压电晶体产生产生机械振动机械振动不充电不充电充电充电(一)分选基本原理(一)分选基本原理.分选速度:分选速度:单位时间内分选的细胞数量。与悬液中单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。细胞的含量成正比。分选纯度:分选纯度:分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。分率。分选收获率:分选收获率:实际收获的分选细胞与设定通过测量点实际
11、收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。分选得率:分选得率:从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量,再经分选后得到目的细胞的实际得率。与总量,再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。分选速度成反比。(二)分选的技术要求(二)分选的技术要求.参数:参数:FS,SS,FLFS,SS,FL数据显示方式数据显示方式 (单参数直方图(单参数直方图 、双参数散点图、双参数散点图 、二维等、二维等高图高图 、假三维等高图、假三维等高图 、三参数散点图、三参数散点图 )设门分析技术设门分析技术 第二节第
12、二节 数据的显示与分析数据的显示与分析.FSFS:反映颗粒的大小:反映颗粒的大小SSSS:反映颗粒的内部结构复杂程度:反映颗粒的内部结构复杂程度FLFL:反映颗粒被染上的荧光数量多少:反映颗粒被染上的荧光数量多少一、一、参数参数.单参数直方图单参数直方图双参数直方图双参数直方图:点图点图 二维等高图二维等高图 假三维等高图假三维等高图三参数直方图三参数直方图多参数分析多参数分析直分析方图直分析方图设门分析设门分析:REGION和和GATE设置设置二、数据显示方式二、数据显示方式.由一维参数由一维参数(散射光或荧光散射光或荧光)与颗粒计数与颗粒计数(COUNT)构成,反映同构成,反映同样散射光或
13、荧光强度的颗粒数量的多少。样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。(一)单参数直方图(一)单参数直方图.单参数直方图单参数直方图细细胞胞相相对对数数量量信道信道(channel(channel ).双参数直方图:纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数,双参数直方图:纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数,根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。双参数信号双参数信号通常采用对数信号,最常用的是点密图,在图中,每通常采用对数信号,最常用的是点密图,在图中,每个点代表一个细胞,点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强个点代表一个细胞,点图利用颗粒
14、密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。度的颗粒数量的多少。(二)双参数直方图(二)双参数直方图.1.双参数直方图点图双参数直方图点图绿色荧光强度绿色荧光强度红红色色荧荧光光强强度度.双参数直方图点图双参数直方图点图.2.二维等高图二维等高图由类似地图上的等高线组成,其本质也是双参数直方图。由类似地图上的等高线组成,其本质也是双参数直方图。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数,即等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数,即“等等高高”。曲线层次越高曲线层次越高(越里面的线越里面的线)所代表的细胞数愈多。所代表的细胞数愈多。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。等高线
15、越密集则表示细胞数变化率越大。.二维等高图二维等高图.3.假三维等高图假三维等高图.(三)三参数直方图(三)三参数直方图.多参数分析:当细胞标记了多色荧光,被激发光激发后,得到的荧多参数分析:当细胞标记了多色荧光,被激发光激发后,得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。(四)流式细胞仪的多参数分析(四)流式细胞仪的多参数分析.Gate Gate设置:指在某一张选定参数的直方图上,根据该图的设置:指在某一张选定参数的直方图上,根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群,并要求该样细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群,并要求该样本所有其他
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