分子生物学:蛋白质组学的研究方法和进展.ppt
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1、萧萧 小小 鹃鹃jocelyn_分子生物学研究中心第九章第九章 蛋白质组学的研究方法和进展蛋白质组学的研究方法和进展分子生物学分子生物学MedicalMolecularBiology One Genome different ProteomesLife is based on proteins and their interactions从基因组学到蛋白质组学从基因组学到蛋白质组学2020世纪生命科学的辉煌成就世纪生命科学的辉煌成就l19531953年年,Watson&Crick提出提出DNADNA双螺旋结构双螺旋结构l19571957年,年,“中心法则中心法则”的问世的问世l2020世纪世纪
2、9090年代,人类基因组计划(年代,人类基因组计划(HGP)基因组计划的局限基因组计划的局限无法解决无法解决“基因精细调基因精细调控控”问题问题大规模基因表达检大规模基因表达检测技术如:微阵列法、测技术如:微阵列法、DNA芯片及芯片及SAGE“mRNA”无法反映蛋白无法反映蛋白质的质与量。质的质与量。以往人类对于蛋白质的研究只是针对生命以往人类对于蛋白质的研究只是针对生命活动中某一种或某几种蛋白质,难以形成一种活动中某一种或某几种蛋白质,难以形成一种整体观,难以系统透彻地阐释生命活动的基本整体观,难以系统透彻地阐释生命活动的基本机制。机制。基因是遗传信息的源头基因是遗传信息的源头功能性蛋白是基
3、因功能的执行体功能性蛋白是基因功能的执行体大规模、全方位的蛋白质研究势在必行大规模、全方位的蛋白质研究势在必行后基因组时代后基因组时代功能基因组学成为研究重心功能基因组学成为研究重心蛋白质组学是其蛋白质组学是其“中流砥柱中流砥柱”,成为,成为战略制高点战略制高点 第一节第一节 蛋白质组学的概念及其发展史蛋白质组学的概念及其发展史什么是蛋白质组?什么是蛋白质组?蛋白质组蛋白质组 “proteomeproteome”一词源于一词源于“PROTEPROTEinin”与与“gengenOMEOME”的杂合。的杂合。F同一基因组在不同细胞、不同组织中的表同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同
4、达情况各不相同 F在空间和时间上动态变化在空间和时间上动态变化 指由一个细胞或一个组织的基因指由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部蛋白质。组所表达的全部蛋白质。蛋白质组学蛋白质组学(proteomics)应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学。应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学。从从整整体体的的角角度度分分析析细细胞胞内内动动态态变变化化的的蛋蛋白白质质组组成成、表表达达水水平平与与修修饰饰状状态态,了了解解蛋蛋白白质质之之间间的的相相互互作作用用与与联联系,揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。系,揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。主要研究内容主要研究内容 v了解某种特定的细
5、胞、组织或器了解某种特定的细胞、组织或器官制造的蛋白质种类;官制造的蛋白质种类;v明确各种蛋白质分子是如何形成类明确各种蛋白质分子是如何形成类似于电路的网络;似于电路的网络;v 描绘蛋白质的精确三维结构,揭示描绘蛋白质的精确三维结构,揭示其结构上的关键部位,如与药物结合其结构上的关键部位,如与药物结合并且决定其活性的部位。并且决定其活性的部位。什么是功能蛋白质组学?什么是功能蛋白质组学?(functionalproteomics)功能蛋白质组:细胞在一定阶段或与某功能蛋白质组:细胞在一定阶段或与某一生理现象相关的所有蛋白质。一生理现象相关的所有蛋白质。介于对个别蛋白质的传统蛋白质化学研介于对个
6、别蛋白质的传统蛋白质化学研究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质组学之间。组学之间。蛋白质组学应用举例蛋白质组学应用举例研究细胞结构功能和分子组成研究细胞结构功能和分子组成发现新的药物靶位点发现新的药物靶位点发现新型生物学活性的分子和药物发现新型生物学活性的分子和药物差异蛋白质组学差异蛋白质组学发现细菌、病毒感染和疾病监测的分子标志物发现细菌、病毒感染和疾病监测的分子标志物修饰蛋白质组学修饰蛋白质组学遗传或药理学扰动的分子解剖遗传或药理学扰动的分子解剖病理生理学研究病理生理学研究植物蛋白质组学植物蛋白质组学相互作用蛋白质组学相互作用蛋白质组学研究药物作用方式和毒性
7、机理研究药物作用方式和毒性机理进进展(国际)展(国际)|19961996年,澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质年,澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心(组研究中心(APAFAPAF)|美国美国NCINCI肺、直肠、乳腺和卵巢等肿瘤的蛋肺、直肠、乳腺和卵巢等肿瘤的蛋白质组数据库白质组数据库|NCINCI与与FDAFDA有关癌症不同发病阶段和治疗阶有关癌症不同发病阶段和治疗阶段的蛋白质组数据库段的蛋白质组数据库|英国、法国、德国、日本等国也分别投入巨资英国、法国、德国、日本等国也分别投入巨资进行蛋白质组学的研究进行蛋白质组学的研究 此外,此外,CeleraCelera公司、日内瓦蛋白质组公司与
8、公司、日内瓦蛋白质组公司与布鲁克质谱仪制造公司也开始参与研究布鲁克质谱仪制造公司也开始参与研究The HUPO WorldThe HUPO WorldCanadaUSAChinaJapanKoreaAsia OceaniaSwedenRussiaUnited KingdomItalyGermanyFranceLatin AmericaAustraliaTheHumanProteomeOrganisation1.Human Liver Proteome Project(HLPP)2.Human Brain Proteome Project(HBPP)3.Proteomic Standards I
9、nitiative(PSI)4.Human Antibody Initiative(HAI)5.Human Plasma proteome Project(HPPP)6.Mouse Models Human Disease(MMHD)7.Human Disease Glycomics/Proteome Initiative(HGPI)8.HUPO Cardiovascular Initiative(HUPO CVI)进进展(国内)展(国内)|国家自然科学基金委于国家自然科学基金委于19971997年设立了重大项年设立了重大项目目“蛋白质组学技术体系的建立蛋白质组学技术体系的建立”|199819
10、98年启动了蛋白质组学研究年启动了蛋白质组学研究|中国科学院生物化学研究所、军事医学科学中国科学院生物化学研究所、军事医学科学院与湖南师范大学已启动蛋白质组研究院与湖南师范大学已启动蛋白质组研究|中国科学院上海生命科学研究院、军事医学中国科学院上海生命科学研究院、军事医学科学院与复旦大学相继成立了专门的蛋白质科学院与复旦大学相继成立了专门的蛋白质组学研究中心组学研究中心|科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973973”计划项目和计划项目和“863863”计划项目计划项目;国国家自然科学基金委员会也将家自然科学基金委员会也将“蛋白质组研蛋白质组研究究”列为重点
11、项目。列为重点项目。|我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面取得了较大的进展白质组研究方面取得了较大的进展 第二节第二节 蛋白质组学研究方法概述蛋白质组学研究方法概述一、蛋白质组表达模式研究方法一、蛋白质组表达模式研究方法l研究蛋白质组的组成成分研究蛋白质组的组成成分 l主要技术有双向凝胶电泳、以质谱为代表主要技术有双向凝胶电泳、以质谱为代表的蛋白质鉴定技术及生物信息学技术。的蛋白质鉴定技术及生物信息学技术。Proteomics TechnologiesProteomics Technologies Biochemical techniquesMas
12、s spectrometry AnalysisBioinformatics Protein Identification(一)蛋白质组研究中的样品制备 采采用用细细胞胞或或组组织织的的全全蛋蛋白白质质组组分分进进行行蛋蛋白质组分析。白质组分析。进进行行样样品品预预分分级级,将将细细胞胞或或组组织织中中的的全全体体蛋蛋白白质质分分成成不不同同部部分分,分分别别进进行行研研究究,可可提提高高低低丰丰度度蛋蛋白白质质的的上上样样量量和和检检测测灵灵敏度敏度。样品预分级的主要依据样品预分级的主要依据蛋白质溶解性:可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白质溶解性:可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白质定位:膜蛋白、核蛋白等
13、蛋白质定位:膜蛋白、核蛋白等蛋白质细胞器定位:线粒体、高尔基体、叶蛋白质细胞器定位:线粒体、高尔基体、叶绿体等绿体等组织水平蛋白质组样品制备组织水平蛋白质组样品制备 原原因因:临临床床样样本本都都是是各各种种细细胞胞或或组组织织混混杂杂,而而且且状状态态不不一一,如如肿肿瘤瘤组组织织中中癌癌变变的的上上皮皮类细胞总是与血管、基质细胞等混杂。类细胞总是与血管、基质细胞等混杂。激光捕获显微切割激光捕获显微切割(lasercapturemicrodissection,LCM)可直接在可直接在显微镜下从组显微镜下从组织切片中精确织切片中精确分离特定的细分离特定的细胞或细胞群。胞或细胞群。LCM纯化肺腺
14、癌细胞纯化肺腺癌细胞A:LCM切割前的肺腺癌组织;切割前的肺腺癌组织;B:LCM切割后肺腺癌组织;切割后肺腺癌组织;C:收集的肺腺癌细胞:收集的肺腺癌细胞肺腺癌转移相关蛋白质的筛选肺腺癌转移相关蛋白质的筛选ABC(二)蛋白质组研究中的样品分离关键技术:关键技术:双向凝胶电泳双向凝胶电泳(two-dimensionalelectrophoresis,2-DE)利用蛋白质等电点和分子量差异,结合利用蛋白质等电点和分子量差异,结合凝胶化学特性,分离各种蛋白质的方法。凝胶化学特性,分离各种蛋白质的方法。工作原理:工作原理:T根据蛋白质等电点的不同进行第一向等电根据蛋白质等电点的不同进行第一向等电聚焦电
15、泳分离聚焦电泳分离T转移到二向转移到二向SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶上,再根聚丙烯酰胺凝胶上,再根据相对分子量大小不同进行分离据相对分子量大小不同进行分离等等电电聚聚焦焦电电泳泳进进行行过过程程中中等等电电聚聚焦焦电电泳泳结结束束后后()()()()()()()()低低pH低低pH高高pH高高pH等电聚焦电泳(等电聚焦电泳(isoelectrophoresisfocusing,IEFIEF)聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液在电场作内的缓冲液在电场作用下沿电场方向在凝用下沿电场方向在凝胶内制造一个胶内制造一个pHpH梯度。梯度。每种蛋白质都将迁移每种蛋白质都将迁移至与它的至与它的pIpI
16、 相一致相一致的的pHpH处。处。第一向第一向IEF电泳电泳固相固相pHpH梯度等电聚焦的优点梯度等电聚焦的优点克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。可以随意精确设定可以随意精确设定pHpH梯度。梯度。尤尤其其可可在在较较窄窄的的pHpH范范围围内内进进行行第第二二轮轮分分析,大大提高了分辨率及重复性。析,大大提高了分辨率及重复性。双向凝胶垂直双向凝胶垂直电泳电泳 双向电泳后的凝胶经染色后蛋白呈现双向电泳后的凝胶经染色后蛋白呈现二维分布图:二维分布图:水平方向反映出蛋白在水平方向反映出蛋白在pIpI上的差异,上的差异,垂直方向反映出它们在分子量上的差别垂直方向反
17、映出它们在分子量上的差别。第二向第二向SDS-PAGE电泳电泳双向电泳方法的主要步骤双向电泳方法的主要步骤:1.样品准备样品准备2.第一向:固相第一向:固相pH梯度等电聚焦梯度等电聚焦3.第二向:第二向:SDS-PAGE电泳电泳4.染色:染色:考马氏亮兰或银染考马氏亮兰或银染5.图像分析:肉眼或自动扫描图像分析:肉眼或自动扫描Isoelectric Focusing(IEF)with IPG strips3-4 mm70-240 mmgelPlastic backing固相固相pH梯度等电聚焦电泳(第一向)示意图梯度等电聚焦电泳(第一向)示意图IEFSDS-PAGESecond Dimensi
18、on:SDS-PAGESDS-PAGE电泳(第二向)示意图电泳(第二向)示意图Gel staining1st dimension IEF2nd dimension SDS-PAGEImaging and data evaluationSpot excision and mass spectrometrySamplepreparationExpression Proteomics with 2D Gel ElectrophoresisDysfunctions,CancerDysfunctions,CancerDrugsDrugsSimultaneousproteinprofilingtounde
19、rstandtheSimultaneousproteinprofilingtounderstandthefunctionandregulationofthousandsofproteinsfunctionandregulationofthousandsofproteins TemperatureTemperatureMetabolicstateMetabolicstateStressStressCultureconditionsCultureconditionsExpression Proteomics with 2D Gel ElectrophoresisDifferentialExpres
20、sion ABE.Coli grown at 30 CE.Coli grown at 42 CDifferential AnalysisProteins fromcultured human cellsA=Derivative of B Protein samples courtesy of Dr.Steven Seeholzer,Fox Chase Cancer CenterABData evaluationControl sampleTreated sample3-4 replicate gels have to be run for each sampleMatchingStandard
21、 MapData evaluationData evaluation2D Gel DatabasesBiobaseBiobase 角质形成细胞角质形成细胞,膀胱癌等膀胱癌等 (丹麦丹麦Center for Genome Research)Center for Genome Research)http:/biobase.dk/cgi-bin/celishttp:/biobase.dk/cgi-bin/celisECO2DBASE ECO2DBASE 大肠杆菌大肠杆菌 (在在NCBINCBI库中库中)ftp:/ncbi.nlm.nih.gov/respository/ECO2DBASEftp:/n
22、cbi.nlm.nih.gov/respository/ECO2DBASEHeart-2DPAGE Heart-2DPAGE 人心肌人心肌 (德国柏林德国柏林)http:/www.chemie.fu-berlin.de/user/pleisshttp:/www.chemie.fu-berlin.de/user/pleissHSC-2DPAGE HSC-2DPAGE 人类心脏人类心脏 (英国英国HarefieldHarefield,Heart Science Center),Heart Science Center)http:/http:/www.harefield.nthames.nhs.uk
23、/nhli/protein/index.htmlwww.harefield.nthames.nhs.uk/nhli/protein/index.htmlLSB LSB 人类人类,小鼠和大鼠肝脏等小鼠和大鼠肝脏等 (美国美国Large Scale Biology)Large Scale Biology)http:/.2dmaps/patterns.htmlhttp:/.2dmaps/patterns.htmlQUESTRef52 QUESTRef52 细胞细胞,大鼠胚胎大鼠胚胎,酵母酵母 (美国美国Cold Spring Harbor Lab)Cold Spring Harbor Lab)htt
24、p:/http:/siva.cshl.orgsiva.cshl.org/SWISS-2DPAGE SWISS-2DPAGE 十个人类图谱十个人类图谱,包括包括:肝肝,浆细胞浆细胞,红细胞红细胞,血小板血小板,以以及酵母及酵母,大肠杆菌大肠杆菌 (瑞士日内瓦瑞士日内瓦,University Hospital)2-DE,University Hospital)2-DE数据库数据库hthttp:/expasy.hcuge.ch/ch2d/ch2d-top.htmltp:/expasy.hcuge.ch/ch2d/ch2d-top.htmlYeast Yeast S.S.cerevisiaecerev
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- 分子生物学 蛋白质 研究 方法 进展
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