聚合酶链反应及其应用.ppt
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1、5 2 3 4 1 6 7 8 PCRPCR的原理与反的原理与反应应条件条件PCRPCR的的DNADNA聚合聚合酶酶与与扩扩增的精确性增的精确性PCRPCR的模板及制的模板及制备备PCRPCR的引物的引物设计设计及合成及合成PCRPCR反反应应的其它控制参数的其它控制参数PCRPCR技技术术的衍生与的衍生与发发展展PCRPCR技技术术在生命科学研究中的在生命科学研究中的应应用用PCRPCR技技术术在在临临床医学方面的床医学方面的应应用用聚合聚合酶链酶链反反应应及其及其应应用用PCRPCR技技术术的的诞诞生与生与发发展展1 PCR1 PCR的原理与反的原理与反应应条件条件PCRPCR技技术术的反
2、的反应应条件条件PCRPCR技技术术的基本原理的基本原理PCRPCR反反应应的的质质量指量指标标PCRPCR技技术术的的诞诞生与生与发发展展 聚合聚合酶链酶链反反应应(Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction,PCRPCR )又称又称为为PCRPCR扩扩增技增技术术,是一种高效、快速、特异性的体外,是一种高效、快速、特异性的体外DNADNA聚合程序。聚合程序。19851985年年,美国美国PE-cetusPE-cetus公司人公司人类遗传类遗传研究室的研究室的Kary mullisKary mullis发发明了具有划明了具有划时时代意
3、代意义义的的PCRPCR技技术术;19881988年年,美国美国PE-cetusPE-cetus公司推出世界上第一台公司推出世界上第一台PCRPCR热热循循环仪环仪,从而使,从而使PCRPCR反反应应自自动动化;化;19931993年年,Kary mullisKary mullis因因发发明明PCRPCR技技术获术获得得诺贝诺贝尔尔化学化学奖奖;19951995年年,定量定量PCRPCR仪诞仪诞生,使定量研究生,使定量研究DNADNA靶序列成靶序列成为现实为现实。PCRPCR技技术术的基本原理的基本原理5555待待扩扩增增DNADNA区域区域55变变性性加加热热5555引物引物退火退火5555
4、底物底物聚合聚合55555555加加热热变变性性555555555555555555555555555555555555退火退火 引物引物底物底物聚合聚合加加热热变变性性引物引物退火退火底物底物聚合聚合112233555555PCRPCR技技术术的反的反应应条件条件DNADNA或或RNARNA模板模板5555待待扩扩增增DNADNA区域区域559494 5 5 minmin55555555退火退火5555聚合聚合5555555555循循环环25-3025-30次次目目标标DNADNA片段达片段达101066-101077变变性性7070DNADNA引物引物DNADNA聚合聚合酶酶dNTPsdN
5、TPsMgMg2+2+(缓缓冲液)冲液)PCRPCR反反应应的的质质量指量指标标 PCR PCR反反应应的的质质量量标标准有:准有:特异性(序列特异性(序列选择选择)有效性(序列有效性(序列产产量)量)上述三大上述三大标标准并非由准并非由单单一因素所决定,因此在一因素所决定,因此在PCRPCR反反应应中必中必须须准确性(序列准确性(序列对错对错)对对多种参数多种参数进进行行联联合控制和改合控制和改进进,但由于,但由于PCRPCR反反应应中的各参数往往中的各参数往往是相互影响的,因此任何参数的改是相互影响的,因此任何参数的改进进不可能同不可能同时满时满足特异性、有效足特异性、有效性、准确性。性、
6、准确性。PCRPCR扩扩增反增反应应的精确性的精确性2 PCR2 PCR的的DNADNA聚合聚合酶酶与与扩扩增的精确性增的精确性用于用于PCRPCR的的DNADNA聚合聚合酶简酶简介介DNADNA聚合聚合酶对酶对PCRPCR精确性的重要影响精确性的重要影响DNADNA聚合聚合酶酶的使用的使用PCRPCR扩扩增反增反应应的精确性的精确性 利用利用PCRPCR技技术扩术扩增增DNADNA靶序列的一个重要靶序列的一个重要问题问题是是这这种种DNADNA体外聚体外聚合反合反应应的序列忠的序列忠实实程度,即程度,即DNADNA扩扩增增产产物序列的物序列的准确率准确率。PCRPCR反反应应的的准确率准确率
7、远远远远低于低于细细胞内的胞内的DNADNA聚合反聚合反应应,除了缺少完善的,除了缺少完善的DNADNA聚合校聚合校正系正系统统外,影响外,影响PCRPCR反反应应准确率的因素准确率的因素还还包括:包括:DNADNA聚合聚合酶酶的保真性能(主要因素)的保真性能(主要因素)DNADNA链链的物理的物理损伤损伤PCRPCR反反应应体系的体系的洁净洁净度度DNADNA聚合聚合酶对酶对PCRPCR精确性的重要影响精确性的重要影响 DNADNA聚合聚合酶酶的保真性主要取决于其的保真性主要取决于其3355 的核酸外切的核酸外切酶酶活性,它活性,它负责对错误掺负责对错误掺入的碱基入的碱基进进行校正。相关研究
8、行校正。相关研究结结果表明,果表明,DNADNA聚合聚合酶酶的的出出错错率在每率在每轮轮延伸每核苷酸延伸每核苷酸1.6 1.6 X 10X 1066-2.1 -2.1 X 10X 1044范范围围内。内。DNADNA聚合聚合酶酶的碱基的碱基掺掺入入错误错误可能可能发发生在其延伸生在其延伸阶阶段的五种活性:段的五种活性:与与dNTPdNTP的的结结合特异性合特异性 磷酸二磷酸二酯键酯键的形成速率的形成速率 焦磷酸的焦磷酸的释释放速率放速率 碱基碱基错误掺错误掺入之后的持入之后的持续续延伸性延伸性 3355 的核酸外切活性的的核酸外切活性的强强弱弱用于用于PCRPCR的的DNADNA聚合聚合酶简酶
9、简介介 Taq DNA Taq DNA酶酶的聚合出的聚合出错错率率较较高(高(2.12.1X10X10-4-4-4-4),因),因为为它没有它没有3355 的的的核酸外切的核酸外切酶酶活性和校正功能。然而通活性和校正功能。然而通过优过优化反化反应应条件,可使条件,可使TaqTaq酶酶的的聚合出聚合出错错率降低到原来的率降低到原来的1/31/3。Taq DNATaq DNA聚合聚合酶酶催化的聚合反催化的聚合反应应的普遍的普遍则则Taq DNATaq DNA酶还酶还常常常常导导致致扩扩增增产产物的缺失突物的缺失突变变。Taq DNATaq DNA聚合聚合酶酶(Thermus aquaticusTh
10、ermus aquaticus)错误类错误类型是由型是由ATAT转换为转换为GCGC;如果模板如果模板DNADNA具有形成二具有形成二级结级结构的可能性构的可能性避免稀避免稀释释保存保存Taq DNATaq DNA聚合聚合酶酶Taq DNATaq DNA聚合聚合酶酶在室温下也具有延伸引物的活性在室温下也具有延伸引物的活性 Taq DNA Taq DNA酶酶在使用在使用时应时应注意:注意:用于用于PCRPCR的的DNADNA聚合聚合酶简酶简介介 KlenTaq DNA KlenTaq DNA聚合聚合酶酶是一种是一种NN端缺失了端缺失了的的Taq DNATaq DNA聚合聚合酶酶,因而,因而没有没
11、有5 5 的核酸外切的核酸外切酶酶活性;活性;KlenTaq DNA KlenTaq DNA聚合聚合酶酶的的MgMg2+2+最佳最佳浓浓度范度范围围很很宽宽,因此很容易,因此很容易优优化化KlenTaq DNAKlenTaq DNA聚合聚合酶酶(Thermus aquaticusThermus aquaticus)在最佳反在最佳反应应条件下,条件下,KlenTaq DNAKlenTaq DNA聚合聚合酶酶出出错错率率为为 5.1 5.1 X 10X 1055,性能略性能略优优于于Taq DNATaq DNA聚合聚合酶酶。反反应应条件;条件;用于用于PCRPCR的的DNADNA聚合聚合酶简酶简介
12、介 Tth DNA Tth DNA聚合聚合酶酶在在MnMn2+2+的存在下,能有效地反的存在下,能有效地反转录长转录长度在度在10001000碱碱基以下的基以下的RNARNA;Tth DNA Tth DNA聚合聚合酶酶在在MgMg2+2+的存在下,能由的存在下,能由DNADNA模板合成模板合成DNADNA;Tth DNATth DNA聚合聚合酶酶(Thermus thermophilusThermus thermophilus)好地克服好地克服RNARNA链链中普遍存在二中普遍存在二级结级结构的构的难题难题。Tth DNA Tth DNA聚合聚合酶酶在在较较高的温度下仍具有逆高的温度下仍具有逆
13、转录酶转录酶活性,因此活性,因此能很能很 用于用于PCRPCR的的DNADNA聚合聚合酶简酶简介介 Pfu Pfu是一种是一种高保真高保真的的DNADNA聚合聚合酶酶,出,出错错率极低;率极低;Pfu DNA Pfu DNA聚合聚合酶扩酶扩增出的增出的产产物物带带有平有平头头末端;末端;Pfu DNA Pfu DNA聚合聚合酶扩酶扩增速度极快,达增速度极快,达1.5-2 1.5-2 min/kbmin/kb;Pfu DNAPfu DNA聚合聚合酶酶(Pyrococcus furiosusPyrococcus furiosus)Pfu DNA Pfu DNA聚合聚合酶酶的的热稳热稳定性很高。定性
14、很高。7.0 7.0 X 10X 1077-1.6 -1.6 X 10X 1066用于用于PCRPCR的的DNADNA聚合聚合酶简酶简介介 Vent DNAVent DNA聚合聚合酶酶具有具有3 3 55 的核酸外切的核酸外切酶酶活性和校正功能,活性和校正功能,因此因此与其它与其它DNADNA聚合聚合酶酶(如(如TaqTaq酶酶)相比,具有相)相比,具有相对较对较好的高保真性,其好的高保真性,其出出错错率率为为2.4 2.4 X 10X 1055-5.7 -5.7 X 10X 1055 ;Vent DNAVent DNA聚合聚合酶酶(Thermococcus litoralisThermoco
15、ccus litoralis)度小于度小于2 2 kbkb时时,扩扩增增产产物的物的长长度与度与MgMg2+2+的的浓浓度并无关度并无关联联;如果如果扩扩增增长长度大于度大于2 2 kbkb,则则需要高于需要高于2 2 mMmM的的MgMg2+2+,而在而在扩扩增增长长 如果模板如果模板链链中存在次黄中存在次黄嘌嘌呤核苷或脱氧尿呤核苷或脱氧尿嘧啶嘧啶核苷,核苷,VentVent DNADNA聚合聚合酶酶不能延伸引物。不能延伸引物。用于用于PCRPCR的的DNADNA聚合聚合酶简酶简介介 DeepVent DNADeepVent DNA聚合聚合酶酶是一种在低温和高温条件下均极其是一种在低温和高温
16、条件下均极其稳稳定的定的聚合聚合酶酶,且能使用广范,且能使用广范围围的的辅辅助溶助溶剂剂如甲如甲酰酰胺和胺和DMSODMSO等;等;DeepVent DNA DeepVent DNA聚合聚合酶酶能能产产生生长长达达14 14 kbkb的的扩扩增增产产物,其物,其外切外切酶酶DeepVent DNADeepVent DNA聚合聚合酶酶(Pyrococcus species GB-DPyrococcus species GB-D)活性活性比比Vent DNAVent DNA聚合聚合酶酶高高 4 4 倍,聚合活性比倍,聚合活性比Taq DNATaq DNA酶酶高高5-155-15倍,倍,度小于度小于
17、2 2 kbkb时时,扩扩增增产产物的物的长长度与度与MgMg2+2+的的浓浓度并无关度并无关联联;如果如果扩扩增增长长度大于度大于2 2 kbkb,则则需要高于需要高于2 2 mMmM的的MgMg2+2+,而在而在扩扩增增长长 如果模板如果模板链链中存在次黄中存在次黄嘌嘌呤核苷或脱氧尿呤核苷或脱氧尿嘧啶嘧啶核苷,核苷,VentVent DNADNA聚合聚合酶酶不能延伸引物。不能延伸引物。出出错错率率比比Vent DNAVent DNA聚合聚合酶酶低低 2 2 倍;倍;用于用于PCRPCR的的DNADNA聚合聚合酶简酶简介介 UlTmaUlTma是一种高保真的是一种高保真的DNADNA聚合聚合
18、酶酶,可以,可以较较高的高的产产量量扩扩增小于增小于3 3 kbkb的的DNADNA靶序列,靶序列,产产物呈平物呈平头头末端。末端。UITma DNAUITma DNA聚合聚合酶酶(Thermotoga maritimaThermotoga maritima)DNADNA聚合聚合酶酶的使用的使用DNADNA聚合聚合酶酶的的标标准使用范准使用范围围:1-5 1-5 Units/Units/m mL L特异性的改特异性的改进进:在建在建议议使用的范使用的范围围内尽可能地降低内尽可能地降低酶浓酶浓度。度。聚合聚合酶酶的的浓浓度是决定度是决定PCRPCR反反应应成本的成本的的重要参数,的重要参数,浓浓
19、度度 过过高不高不仅仅能降特异性,同能降特异性,同时时也也导导致不必要的消耗。致不必要的消耗。准确性的改准确性的改进进:建建议议使用高保真的使用高保真的DNADNA聚合聚合酶酶 PCRPCR模板制模板制备备与与纯纯化化3 PCR3 PCR的模板与制的模板与制备备PCRPCR模板的使用模板的使用粗粗样样品中的品中的PCRPCR抑制抑制剂剂PCRPCR模板制模板制备备与与纯纯化化 DNA DNA和和RNARNA均可作均可作为为PCRPCR扩扩增反增反应应的模板,但一般情况下,的模板,但一般情况下,mRNAmRNA先逆先逆转录转录成成cDNAcDNA再再进进行行扩扩增。增。PCRPCR模板的来源主要
20、有两大模板的来源主要有两大类类:纯净纯净物物 如重如重组质组质粒、制粒、制备备的染色体的染色体DNADNA、回收的回收的DNADNA片片段段粗粗样样品品 如如粪粪便、便、脑脑脊髓液、血液、食物、脊髓液、血液、食物、动动物物贝贝壳、土壤、壳、土壤、尿液、唾液、福尿液、唾液、福尔马尔马林固定林固定剂剂、组织组织切片、切片、脓脓汁、汁、喷喷 嚏液、痰液等嚏液、痰液等 上述粗上述粗样样品品含有大量的含有大量的PCRPCR反反应应抑制物抑制物质质,因此如何,因此如何去除去除这这些种些种类类繁多的繁多的抑制抑制剂剂或者或者添加添加必要的必要的PCRPCR反反应应增增强剂强剂显显得十分重要。得十分重要。PC
21、RPCR模板制模板制备备与与纯纯化化 从各种从各种粗粗样样品中去除品中去除PCRPCR反反应应抑制抑制剂剂的程序不尽相同,但常用的的程序不尽相同,但常用的手段包括:手段包括:样样品稀品稀释释溶溶剂剂萃取(萃取(氯氯仿仿异戊基乙醇异戊基乙醇 491 491 )乙醇沉淀乙醇沉淀高速离心高速离心超超滤滤粗粗样样品中的品中的PCRPCR抑制抑制剂剂粪粪便便 胆胆盐盐、胆、胆红红素(抑制素(抑制浓浓度度5050m mg/mLg/mL)血液血液 亚铁亚铁血血红红素、聚乙醇磺酸素、聚乙醇磺酸钠钠、heparinheparin(抗凝抗凝剂剂)土壤土壤 腐殖物腐殖物质质、含、含铁铁化合化合物物植物植物 硫酸右旋
22、糖苷硫酸右旋糖苷 食品食品 未未鉴鉴定的抑制定的抑制剂剂痰液痰液 未未鉴鉴定的抑制定的抑制剂剂PCRPCR模板的使用模板的使用PCRPCR模板模板的的标标准使用范准使用范围围:101022-10-1055 拷拷贝贝 特异性的改特异性的改进进:增加模板增加模板DNADNA的量、降低引物与模板的分子比的量、降低引物与模板的分子比 有效性的改有效性的改进进:增加引物与模板的分子比增加引物与模板的分子比 模板模板浓浓度的度的变变化很大程度上取决于待化很大程度上取决于待扩扩增的碱基序列,但一般增的碱基序列,但一般而言,模板而言,模板DNADNA长长度小,度小,PCRPCR扩扩增增产产物的量就大,因此物的
23、量就大,因此对对于大分子于大分子量的模板量的模板DNADNA(尤其是真核生物基因尤其是真核生物基因组组DNADNA),),在在扩扩增之前最好先增之前最好先用超声波用超声波处处理或限制性理或限制性酶酶消化消化。PCRPCR引物的引物的设计设计原原则则4 4 PCRPCR的引物的引物设计设计及合成及合成PCRPCR引物的使用引物的使用引物的在引物的在线设计线设计工具及免工具及免费软费软件件简简介介PCRPCR引物的引物的设计设计原原则则 选择选择合适的引物是合适的引物是PCRPCR实验设计实验设计的重要步的重要步骤骤,合适引物最基本的,合适引物最基本的引物的引物的长长度度标标准就是与靶序列的准就是
24、与靶序列的高特异性高特异性杂杂交交。为为达到此目的,引物达到此目的,引物设计应设计应注意注意下列几点:下列几点:理想的引物理想的引物长长度度应该应该在在18-3018-30个碱基之个碱基之间间,常,常见见的是的是20-2720-27个碱基个碱基PCRPCR引物的引物的设计设计原原则则引物的引物的GCGC含量含量 引物序列中的引物序列中的GCGC含量含量应应在在35%-65%35%-65%之之间间,最好在,最好在45%-55%45%-55%范范围围内。如果因靶序列的原因,引物不得不含有内。如果因靶序列的原因,引物不得不含有过过高高的的GCGC碱基,那么就碱基,那么就在其在其55端端设计设计一串一
25、串A A或或T T;同同样样,如果引物中的,如果引物中的ATAT含量含量过过高,就在其高,就在其 55 端端设计设计一串一串GG或或CC,以便将整条引物的以便将整条引物的GCGC含量控制在合适的范含量控制在合适的范围围内。内。PCRPCR引物的引物的设计设计原原则则退火温度(退火温度(TaTa)引物的退火温度一般要比估引物的退火温度一般要比估计计的相的相应应熔点温度低熔点温度低5 5左右,在很多左右,在很多情况下,两条引物的退火温度不尽相同,只要两者相差不到情况下,两条引物的退火温度不尽相同,只要两者相差不到4-4-6 6,尚尚不至于影响不至于影响RCRRCR扩扩增反增反应应的的产产量,但它量
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