显微镜的概述.pptx

1n1 1、光光学学显显微微镜镜有有哪哪些些光光学学参参数数？如如何何正正确应用这些参数？确应用这些参数？n2 2、什什么么叫叫数数值值孔孔径径、放放大大率率和和分分辨辨率率？他他们们由由哪哪些些因因素素决决定定以以及及他他们们之之间间有有何何关关系？系？n3 3、透透镜镜有有几几种种像像差差？怎怎样样产产生生的的?如如何何消消除？除？n4 4、物物镜镜与与目目镜镜在在工工作作条条件件和和技技术术要要求求上上有些什么不同？如何正确使用？有些什么不同？如何正确使用？n5 5、物镜上标有、物镜上标有“10/0.2510/0.25”，“160/0.17160/0.17”，请说明这些数字所表示的，请说明这些数字所表示的意义？意义？2n6 6、可变光栏的作用是什么？、可变光栏的作用是什么？n7 7、显微镜的、显微镜的聚光镜与物镜的怎样进行搭配聚光镜与物镜的怎样进行搭配聚光镜与物镜的怎样进行搭配聚光镜与物镜的怎样进行搭配？n n8 8 8 8、显微镜照明系统的基本要求是、显微镜照明系统的基本要求是、显微镜照明系统的基本要求是、显微镜照明系统的基本要求是什么？什么？n9 9、显微镜、显微镜的照明方式分为几种？各有何特的照明方式分为几种？各有何特的照明方式分为几种？各有何特的照明方式分为几种？各有何特点？点？点？点？n n10101010、显微镜的光学系统有哪几部分组成？、显微镜的光学系统有哪几部分组成？、显微镜的光学系统有哪几部分组成？、显微镜的光学系统有哪几部分组成？各起什么作用？各起什么作用？各起什么作用？各起什么作用？3 光学显微镜光学显微镜(optical microscope)简称光镜简称光镜或显微镜，是一种将肉眼无法直接看清楚的或显微镜，是一种将肉眼无法直接看清楚的微小物体进行光学放大成像的常用仪器。微小物体进行光学放大成像的常用仪器。第一节第一节 光学显微镜概述光学显微镜概述4一、光学显微镜的发展简史一、光学显微镜的发展简史 5 荷兰的眼镜商詹森（Zaccharias Janssen）Janssen和他的显微镜世界上最早的一台显微镜显微镜的发展历史 16世纪56nMarcello Malpighi通过显微镜为血液循环理论提供了证据 nRobert Hook改进了显微镜，并发现了细胞 显微镜的发展历史 17世纪Robert Hooke和他的显微镜67Hooke观察到的软木片的细胞结构Hooke显微镜下的跳蚤78n荷兰人安东尼冯列文虎克（Anthony Von Leeuwenhoek)列文虎克的显微镜显微镜的发展历史 17世纪89n现代的光学显微镜显微镜的发展历史 1819世纪910根据不同的使用用途，光学显微镜可分为根据不同的使用用途，光学显微镜可分为:n普通光学显微镜普通光学显微镜n暗视野显微镜暗视野显微镜n相差显微镜相差显微镜n荧光显微镜荧光显微镜n倒置显微镜倒置显微镜n体视显微镜体视显微镜n偏光显微镜等偏光显微镜等10多种。多种。11普通的光学显微镜是由两组透镜所组成，普通的光学显微镜是由两组透镜所组成，左边小的透镜代表一组焦距很短的透镜组，左边小的透镜代表一组焦距很短的透镜组，称为物镜；右边一组焦距较长的透镜组称为称为物镜；右边一组焦距较长的透镜组称为目镜。其成像原理如图所示。目镜。其成像原理如图所示。二、显微镜的光学原理12显微镜的成像原理图经物镜、目镜放大后得到经物镜、目镜放大后得到放大的倒立放大的倒立的虚像。的虚像。13In the compound microscope,the objective forms a real,inverted image at the eyepiece front focal plane(the primary image plane)14二、显微镜的光学原理）将将被被观观察察的的物物体体AB置置于于物物镜镜前前的的物物方方焦焦点点F1稍稍外外的的地地方方，物物体体AB发发出出的的光光线线经经物物镜镜O1放放大后成一倒立实像大后成一倒立实像AB于目镜前焦点附近；于目镜前焦点附近；15）再再经经目目镜镜O2放放大大后后，我我们们就就可可以以获获得得一一个个经经两两次次放放大大的的倒倒立立虚虚像像AB，该该虚虚像像呈现在观察者的明视距离处。呈现在观察者的明视距离处。16三、显微镜的性能参数三、显微镜的性能参数 n（一）数值孔径一）数值孔径 n（二）分辨率二）分辨率n（三）放大率（三）放大率n（四）（四）视野（视场）视野（视场）n（五）景深（五）景深（焦点深度）（焦点深度）n（六）工作距离（六）工作距离 n（七）镜象亮度（七）镜象亮度n（八）清晰度（八）清晰度 17（一）数值孔径一）数值孔径n数数值值孔孔径径(numerical aperture)的的概概念念：又又叫叫做做镜镜口口率率，简简写写为为N.A.。表表示示物物镜镜吸吸光光本本领领的的大大小小，常常用用物物体体与与物物镜镜间间介介质质的的折折射射率率n与与物物镜镜镜镜口口角角的的一一半半(/2)的正弦值的乘积来表示的正弦值的乘积来表示(如图所示如图所示)；n 数值孔径的数学表达式：数值孔径的数学表达式：N.A.=nsin/218镜口角的概念：被观察点射入物镜边缘光线镜口角的概念：被观察点射入物镜边缘光线间的夹角是一个圆锥角叫镜口角。间的夹角是一个圆锥角叫镜口角。/2物镜的镜口角物镜的镜口角镜片镜片19镜口角镜口角的大小能说明什么？的大小能说明什么？n镜口角的大小能说镜口角的大小能说明进入物镜光量的明进入物镜光量的多少。镜口角越大多少。镜口角越大进入的光量越多，进入的光量越多，此物镜的聚光本领此物镜的聚光本领越强，物像的量度越强，物像的量度越大，物像就更清越大，物像就更清楚、明显。楚、明显。20数值孔径的意义数值孔径的意义：数值孔径是衡量显微镜数值孔径是衡量显微镜性能的极为重要的一个性能的极为重要的一个技术参数，它决定或影技术参数，它决定或影响着显微镜的其它性能响着显微镜的其它性能参数。参数。1 1）它与放大率成正比，）它与放大率成正比，与景深成反比；与景深成反比；2 2）它的平方与图像亮）它的平方与图像亮度成正比；度成正比；3 3）数值孔径越大，其）数值孔径越大，其视场和工作距离则越小视场和工作距离则越小。21提高数值孔径的方法：N.A.=nsin/2一、增大镜口角一、增大镜口角；二二、增增大大物物镜镜与与标标本本之之间介质的折射率间介质的折射率n。22数值孔径增大的程度数值孔径增大的程度：n采取采取增大镜口角增大镜口角方法时，方法时，可以让标本与物镜尽量靠可以让标本与物镜尽量靠近；近；n采取增大折射率采取增大折射率n方法时，方法时，23例如：设例如：设=111012,当物镜与标本之间以空当物镜与标本之间以空气为介质时气为介质时，数值孔径数值孔径:N.A.=nsin/2=1 sin 111012/20.83 24当物镜与标本之间以香柏油为介质当物镜与标本之间以香柏油为介质时时，数值孔径数值孔径:N.A.=nsin/2=1.515 sin 111012/2 1.25 可见，在可见，在相同的情况下，加入香柏油以后，相同的情况下，加入香柏油以后，可使数值孔径由可使数值孔径由0.83提高到提高到1.25。目前，在实用范围内，油镜所能达到的最大目前，在实用范围内，油镜所能达到的最大数值孔径为数值孔径为1.41.4。25（二）分辨率二）分辨率n分辨率的概念：又称分辨率的概念：又称鉴别率或分辨本领，鉴别率或分辨本领，是指显微镜分辨被检是指显微镜分辨被检物体的微细结构的能物体的微细结构的能力。力。n分辨距离的概念：是分辨距离的概念：是指能被分辨开的两物指能被分辨开的两物点间的最小距离。点间的最小距离。26衍射斑的概念：衍射斑的概念：n根据光的衍射理根据光的衍射理论，点光源放出论，点光源放出的光波经透镜会的光波经透镜会聚后并不是一个聚后并不是一个理想的清晰的亮理想的清晰的亮点，而是一个中点，而是一个中央亮、外面依次央亮、外面依次是暗明相间的环，是暗明相间的环，称作衍射斑。称作衍射斑。平平 行行光束光束单单 缝缝衍射衍射双双 缝缝衍射衍射光波的衍射光波的衍射（Diffraction）衍射：当一束平行光通过窄的开口如狭缝衍射：当一束平行光通过窄的开口如狭缝时发生弯曲的现象。时发生弯曲的现象。27瑞利条件（根据光的衍射理论）：两个相邻的点两个相邻的点光源能够经光学折射光源能够经光学折射系统被分辨开来的必系统被分辨开来的必要条件是每一个衍射要条件是每一个衍射斑的中央亮圆中心落斑的中央亮圆中心落在另一个衍射斑的第在另一个衍射斑的第一暗环上。瑞利以此一暗环上。瑞利以此作为光学系统的分辨作为光学系统的分辨极限，称为瑞利条件极限，称为瑞利条件。平平行行光光束束单单缝缝衍衍射射双双缝缝衍衍射射光波的衍射光波的衍射（Diffraction）衍射：当一束平行光通过窄的开口如狭缝时发衍射：当一束平行光通过窄的开口如狭缝时发生弯曲的现象。生弯曲的现象。28Airy Disk Formation by Finite Objective ApertureThe width of central maximumprop.to andinversly prop.toobjective aperature2929光学显微镜的分辨本领30分辨率与分辨距离的关系：分辨率与分辨距离的关系：n它与它与“分辨距离分辨距离”成反比。分辨距离越小，成反比。分辨距离越小，显微镜的分辨率越高。如果两物点间的距显微镜的分辨率越高。如果两物点间的距离小于分辨距离，就会把两点看成一点，离小于分辨距离，就会把两点看成一点，也就不能看清它的结构。也就不能看清它的结构。n显微镜的分辨率是由物镜来决定的。显微镜的分辨率是由物镜来决定的。n目镜只起目镜只起“放大镜放大镜”的作用，并不提高显的作用，并不提高显微镜的分辨率。微镜的分辨率。31物镜的分辨距离的数学表达式物镜的分辨距离的数学表达式：n在在普普通通中中心心照照明明的的情情况况下下，物物镜的分辨距离由下式决定：镜的分辨距离由下式决定：d=/2N.A.式式中中d表表示示分分辨辨距距离离，入入表表示示照明光线的波长。照明光线的波长。32 用可见光照明的普通显微镜，分用可见光照明的普通显微镜，分 辨距离的极限是多少？辨距离的极限是多少？n在在可可见见光光中中亮亮度度最最大大而而且且对对人人眼眼最最敏敏感感的波长为的波长为0.55um；n物镜最大的物镜最大的N.A.为为1.4；n代入公式：代入公式：d=/2N.A.n可得：可得：d0.55(2X1.4)0.2um。n即即利利用用可可见见光光的的普普通通显显微微镜镜，在在中中心心照照明的情况下，分辨距离的极限为明的情况下，分辨距离的极限为0.2um。33提高物镜的分辨率的方法提高物镜的分辨率的方法：n分辨距离公式：分辨距离公式：d=/2N.A.n1）、提高物镜的数值孔径）、提高物镜的数值孔径N.A.。n2）、使用波长较短的照明光线。）、使用波长较短的照明光线。34 利用紫外线作为光源的分辨距离与利用紫外线作为光源的分辨距离与可见光的比较：可见光的比较：n紫紫外外线线的的波波长长比比可可见见光光短短，约约为为0.27um，可见光波长为可见光波长为0.55um；n利利用用紫紫外外线线作作为为光光源源的的紫紫外外显显微微镜镜，分分辨辨距距离公式：离公式：d=/2N.A进行计算；进行计算；n其其分分辨辨率率高高于于可可见见光光一一倍倍，分分辨辨距距离离可可达达0.1um。但但因因为为眼眼睛睛看看不不见见紫紫外外线线，只只有有拍拍成成照照片片以以后后再再观观察察。比比紫紫外外线线的的波波长长更更短短的的还还有有x射射线线，射射线线等等，但但目目前前没没有有发发现现可可用用的透镜材料。的透镜材料。3536（三）放大率（三）放大率显微镜的放大率的概念：显微镜的放大率的概念：指指物物体体经经物物镜镜、目目镜镜两两次次成成像像后后眼眼睛睛所所能能看看到到像像的的大大小小与与原原物物体大小的比值。体大小的比值。即即是是物物镜镜的的单单向向放放大大率率m和和目目镜的角放大率镜的角放大率的乘积。的乘积。37显微镜的放大率数学表达式：显微镜的放大率数学表达式：M=m=L/f物物250/f目目 式中式中M表示显微镜的总放大率；表示显微镜的总放大率；L/f物物表示物镜的放大率；表示物镜的放大率；250/f目目表示目镜的放大率；表示目镜的放大率；L表示显微镜的光学筒长；表示显微镜的光学筒长；f物物表示物镜的焦距；表示物镜的焦距；f目目表示目镜的焦距；表示目镜的焦距；250(毫米毫米)表示明视距离。表示明视距离。38为什么显微镜的放大率不能无限的增大？为什么显微镜的放大率不能无限的增大？1）M=m=L/f物物250/f目目 从公式可知，物镜和目镜的焦距愈短，光学从公式可知，物镜和目镜的焦距愈短，光学筒长愈长，总放大率愈大。但焦距太短或筒长愈长，总放大率愈大。但焦距太短或镜筒过长，都会造成工作不方便。因此，镜筒过长，都会造成工作不方便。因此，显微镜的放大率不能无限的增大。显微镜的放大率不能无限的增大。2）显微镜的放大率是受分辨率制约的。如）显微镜的放大率是受分辨率制约的。如果标本的细节不能分开来，过度的放大，果标本的细节不能分开来，过度的放大，毫无意义。毫无意义。39显微镜将标本的细节分辨清的条件显微镜将标本的细节分辨清的条件：要看清标本的细节，必须同时满足两个条件：要看清标本的细节，必须同时满足两个条件：1 1）物镜有足够的分辨率，以保证像不互相重）物镜有足够的分辨率，以保证像不互相重叠；（叠；（d=/2N.A.)d=/2N.A.)2 2）显微镜有足够的放大率，以保证像在眼中）显微镜有足够的放大率，以保证像在眼中所张的视角大于所张的视角大于1分分(小于小于1分时眼睛看不见分时眼睛看不见)。这两个条件缺一不可，否则就看不清或看不见这两个条件缺一不可，否则就看不清或看不见像的细节。像的细节。40显微镜最合适的总放大率：显显微微镜镜最最合合适适的的总总放放大大率率(称称为为有有效效放放大大率率，用用M有有效效表表示示)是是在在物物镜镜数数值值孔孔径径的的5001000倍之间。倍之间。即即500N.A.M有效有效1000N.A.在在有有效效放放大大率率范范围围内内，眼眼睛睛可可以以长长时时间间观观察察而而不不易易疲疲劳劳。如如果果总总放放大大率率低低于于500N.A.，观观察察起起来来很很吃吃力力。反反之之，如如果果高高于于1000N.A.，则则会会使使像像质质变变坏坏，甚至造成不真实的像。甚至造成不真实的像。41n标本的细节首先必须由物镜分辨开来，然标本的细节首先必须由物镜分辨开来，然后再把它放大到适合眼睛观察的程度就可后再把它放大到适合眼睛观察的程度就可以了。以了。n实验证明：对眼睛来说视角放大到实验证明：对眼睛来说视角放大到2分分4分分之间最合适。之间最合适。眼睛可以长时间观察而不易眼睛可以长时间观察而不易疲劳。疲劳。n视角是指眼睛里水晶体中心至被观察的物视角是指眼睛里水晶体中心至被观察的物象两端点的连线之间的夹角，如图所示。象两端点的连线之间的夹角，如图所示。视角视角ABAB放大后的物象放大后的物象42 现将视角现将视角为为2分（分（=0.00058弧度）时的情弧度）时的情况如下：设显微镜的总放大率况如下：设显微镜的总放大率M，则放大后，则放大后两细节间的距离为两细节间的距离为Md，而且成象在明视距，而且成象在明视距离离250mm处，如图所示。处，如图所示。250mm=2分Md假定两细节间的距离为假定两细节间的距离为d，把视角放大到，把视角放大到2分与分与4分分之间时之间时,显微镜的最合适的总有效放大率为多少？显微镜的最合适的总有效放大率为多少？43 则有：则有：tan=Md/250 (因因很小时，很小时，tan）或：或：0.00058=Md/250 将公式将公式 d=/2N.A.代入上式，并取代入上式，并取 =0.55um=0.55x10-3mm，整理后可得：，整理后可得：M=527N.A.500N.A.用同样的方法可以计算：当视角为用同样的方法可以计算：当视角为4分时分时 M 1000N.A.Md250mm44（四）视野（视场）n视野的概念：又称视场视野的概念：又称视场(field)，是指显，是指显微镜一次所能看到被检标本的范围。微镜一次所能看到被检标本的范围。n视野宽度：由于它由目镜的视场光阑局视野宽度：由于它由目镜的视场光阑局限成圆形，则把该圆形视野的直径称为限成圆形，则把该圆形视野的直径称为视野宽度视野宽度d。45视野宽度与视野的关系：视野宽度与视野的关系：nd取决于物镜的放大倍取决于物镜的放大倍数及目镜的光阑大小，数及目镜的光阑大小，小放大倍数和大光阑小放大倍数和大光阑可获得较大的视野。可获得较大的视野。n当视野中不能容放整当视野中不能容放整个标本时，要通过机个标本时，要通过机械装置移动标本进行械装置移动标本进行分区或连续移动观察。分区或连续移动观察。46视野（视场）与放大率的关系：视野的大小与显微镜的总放大视野的大小与显微镜的总放大率成反比，总放大率愈大，视野率成反比，总放大率愈大，视野越小。越小。47(五五)景深（焦点深度）景深（焦点深度）(depth of field)n景深又称焦点深度景深又称焦点深度(focal depth)，是指，是指当显微镜调焦于某一当显微镜调焦于某一物平面物平面(对准平面对准平面)时，时，位于对准平面前后二位于对准平面前后二侧的二个仍能清楚观侧的二个仍能清楚观察的平面间的距离。察的平面间的距离。（不仅这一物平面可（不仅这一物平面可以看清楚，而且和它以看清楚，而且和它相连的上下物平面也相连的上下物平面也同时看清楚，这上下同时看清楚，这上下两物平面之间的距离两物平面之间的距离叫做焦点深度。）叫做焦点深度。）48n显微镜的数值孔径愈大，景深愈小。显微镜的数值孔径愈大，景深愈小。n总放率愈大，景深愈小。总放率愈大，景深愈小。例如：使用例如：使用N.A.N.A.为为1.251.25，100 x100 x的油镜，的油镜，配以配以12.5x12.5x的目镜观察时，景深只有的目镜观察时，景深只有0.27um0.27um，调焦后一次只能看清楚，调焦后一次只能看清楚0.27um0.27um厚的一个薄厚的一个薄层。层。显微镜的景深与其它参数的关系显微镜的景深与其它参数的关系：49(六)工作距离n工工作作距距离离是是指指显显微微镜镜调调焦焦后后，在在使使用用标标准准盖盖波波片片和和标标准准机机械械筒筒长长的的情情况况下下，物物镜镜前前透透镜镜的的下下表表面面至至盖盖波波片片上上表表面面之之间间的的距距离离。（从从物物镜镜前前表表面面中中心心到到被被观观察察标标本本之之间间满满足足工工作作要要求求的的距距离离范范围。）围。）50物镜与工作距离的关系：物镜与工作距离的关系：n物镜的放大倍数愈高，工作距离愈短。物镜的放大倍数愈高，工作距离愈短。n一般一般“10 x”以下的低倍物镜，工作距离为以下的低倍物镜，工作距离为57mm。“40 x”的高倍物镜，工作距离为的高倍物镜，工作距离为0.5mm左右。左右。“100 x”的油镜，工作距离只有的油镜，工作距离只有0.19mm左右。左右。51（七）镜象亮度n镜镜象象亮亮度度是是指指显显微微镜镜中中所所看看到到的的物物象象的的亮亮暗程度。暗程度。n高高倍倍率率工工作作条条件件下下的的暗暗场场、偏偏光光、摄摄影影显显微微镜镜等等都都需需要要足足够够的的亮亮度度，与与照照明明及及物物镜镜的性能参数相关。的性能参数相关。n镜镜像像清清晰晰度度是是指指图图像像的的轮轮廓廓清清晰晰、衬衬度度适适中的程度中的程度52镜象亮度与物镜的性能参数的关系镜象亮度与物镜的性能参数的关系：n镜象亮度与数值孔径的平方成正比，与总镜象亮度与数值孔径的平方成正比，与总放大率的平方成反比。放大率的平方成反比。n从使用和保管的角度来说，有许多地方值从使用和保管的角度来说，有许多地方值得注意，如盖玻片的厚度不合格，调焦没得注意，如盖玻片的厚度不合格，调焦没有调到理想位置，总放大率用的过大，使有调到理想位置，总放大率用的过大，使用油镜后，没有及时把香柏油檫干净，镜用油镜后，没有及时把香柏油檫干净，镜片生霉生雾等，都会使象的清晰度受到破片生霉生雾等，都会使象的清晰度受到破坏。坏。