蛋白质检测方法.doc

蛋白质得检测(参考GB/Ｔ6４32-9４)
一、原理
凯氏定氮法测定试样中得含氮量,即在催化剂作用下,用浓硫酸破坏有机物,使含氮物转化为硫酸铵、加入强碱进行蒸馏使氮溢出,再用酸滴定,测出氮含量,将结果乘以换算系数６。25,计算出粗蛋白含量。
二、试剂
（1） 硫酸 化学纯,含量为９8%,无氮;
（2） 混合催化剂 ０.4g硫酸铜,含５个结晶水,6g硫酸钾或硫酸钠,均为化学纯,磨碎混匀;
（3） 氢氧化钠 化学纯,4０%水溶液(m/Ｖ);
（4） 硼酸 化学纯,２％水溶液(m/V);
（5） 混合指示剂 甲基红0。1％乙醇溶液,溴甲酚绿0.5％乙醇溶液,两溶液等体积混合,在阴凉处保存期为3个月;
（6） 盐酸标准溶液　基准无水碳酸钠法标定;
a) 0、1mol/l盐酸标准溶液:８、3ｍＬ盐酸注入1０00ｍL蒸馏水中。
b) ０。0２mol／l盐酸标准溶液:1.67ｍL盐酸注入1０00mＬ蒸馏水中、
（7） 蔗糖 分析纯;
（8） 硫酸铵 分析纯,干燥;
（9） 硼酸吸收液 1％硼酸水溶液1０00mL,加入0、1%溴甲酚绿乙醇溶液1０mL,0.1%甲基红乙醇溶液7ｍL,4％氢氧化钠水溶液,混合,置阴凉处保存期为1个月(全自动程序用)、
三、仪器设备
（1） 实验室用样品粉碎机或研钵;
（2） 分样筛 孔径０、45mm(40目);
（3） 分析天平　感重0、0001ｇ;
（4） 消煮炉或电炉;
（5） 滴定管 酸式,1０、２5mL;
（6） 凯氏烧瓶 250mＬ;
（7） 凯氏蒸馏装置　常量直接蒸馏式或半微量水蒸气蒸馏式;
（8） 锥形瓶 15０、２50mL;
（9） 容量瓶 100mＬ;
（10） 消煮管　2５0mL;
（11） 定氮仪 以凯氏原理制造得各类型半自动、全自动蛋白质测定仪。
四、分析步骤
（一） 仲裁法
1. 试样得消煮 称取试样0。5－１g(含氮量5－80mg)(精确至0、０0０２ｇ),放入凯式烧瓶中,加入6、４ｇ混合催化剂,与试样混合均匀,再加入12mL硫酸与2粒玻璃珠,将凯式烧瓶置于电炉上加热,开始小火,待样品焦化、泡沫消失后,再加强活力(3６0-４10℃)直至呈透明得蓝绿色,然后再继续加热,消化全过程至少2h。
2. 氨得蒸馏
（1） 常量蒸馏法 将试样消煮液冷却,加入６0-10０mＬ蒸馏水,摇匀,冷却、将蒸馏装置得冷凝管末端浸入装有2５mL硼酸吸收液与2滴混合指示剂得锥形瓶内。然后小心地向凯式烧瓶中加入5０mL氢氧化钠溶液,轻轻摇动凯式烧瓶,使溶液混匀后再加热蒸馏,直至流出液体体积为100ｍＬ。降下锥形瓶,使冷凝管末端离开液面,继续蒸馏１-2miｎ,并用蒸馏水冲洗冷凝管末端,洗液均流入锥形瓶内,然后停止蒸馏、
（2） 半微量蒸馏法 将试样消煮液冷却,加入20mＬ蒸馏水,转入1０0mL容量瓶中,冷却后用水稀释至刻度,摇匀,作为试样分解液、将半微量蒸馏装置得冷凝管末端浸入装有2０ｍL硼酸吸收液与2滴混合指示剂得锥形瓶内。蒸汽发生器得水中应加入甲基红指示剂数滴,在蒸馏过程中保持此液为橙红色,否则需补充硫酸、准确移取试样分解液1０—20mL注入蒸馏装置得反应室中,用少量蒸馏水冲洗进样入口,塞好入口玻璃塞,再加10mＬ氢氧化钠溶液,小心提起玻璃塞使之流入反应室,将玻璃塞塞好,且在入口处加水密封,防止漏气。蒸馏4min降下锥形瓶使冷凝管末端离开吸收液面,再蒸馏1min,用蒸馏水冲洗冷凝管末端,洗液均流入锥形瓶内,然后停止蒸馏。
注:两种蒸馏法测定结果相近,可任选一种、
（3） 蒸馏步骤得检验　精确称取0、2g硫酸铵,代替试样,选仲裁法或推荐法“氨得蒸馏"中得步骤进行操作,测得硫酸铵含量为21。1９%±0.2%,否则应检查加碱、蒸馏与滴定各步骤就是否正确。
（二） 推荐法
1. 试样得消煮 称取0、5—1ｇ试样(含氮量５-80mg)(精确至0.0002g),加入消化管中,加2片消化片(仪器自备)或6.4g混合催化剂,与420℃下在消煮炉上消化１h、取出冷却后加入3０mL蒸馏水。
2. 氨得蒸馏 采用全自动定氮仪时,按仪器本身常量程序进行测定。
采用半自动定氮仪时,将带消化液得管子插在蒸馏装置上,以25mL硼酸为吸收液,加入２滴混合指示剂,蒸馏装置得冷凝管末端要浸入装有吸收液得锥形瓶内,然后向消煮管中加入5０mＬ氢氧化钠溶液进行蒸馏。蒸馏时间以吸收液体积达到100mＬ为宜。降下锥形瓶,用蒸馏水冲洗冷凝管末端,洗液均流入锥形瓶内。
3. 滴定　用0、1mol/L得盐酸标准溶液滴定吸收液,溶液由蓝色变成红色为终点、
五、空白测定
称取蔗糖0。5g,代替试样,进行空白测定,消耗0、1mol/L盐酸溶液得体积不得超过0.2mL、消耗0.02mol/L盐酸标准溶液体积不得超过０、3mL。
六、分析结果得计算与表述
计算见下式:
粗蛋白质=
式中:V2——滴定试样时所需标准酸溶液体积,ｍL;
　　 V1——滴定空白时所需标准酸溶液体积,mＬ;
　 　　　c——盐酸标准溶液浓度,mol/L;
　 m--试样质量,g
　 　 V——试样分解液总体积,mL
　 V’—-试样分解液蒸馏用体积,mL;
0、0140——与１.00mL盐酸标准液【c(HCL)=1.000moｌ／L】相当得、以克表示得氮得质量。
6、2５-—氮换算成蛋白质得平均系数。
七、 重复性
当粗蛋白质含量在25%以上时,允许相对偏差为1％。
当粗蛋白质含量在10%—25％以上时,允许相对偏差为２％。
当粗蛋白质含量在10％以下时,允许相对偏差为3%。
浙江紫香糖业使用得定氮仪就是上海新嘉
型号:ＫDN－AZ智能型定氮仪蒸馏器　
KＤＮ-AＺ智能型定氮仪就是我公司根据用户对仪器自动化得需求进行改进得一款半自动凯氏测定装置,在A型得基础上安装了自动蒸馏控制元件,使原本繁琐得蒸馏控制更为简便,提升了工作效率,保证了样品测定得精准性,并且加装了自动排水系统,用户不用担心因蒸发炉水未排尽而造成下次开机出现烧保险丝得烦恼。
测定范围:0。1－200mg氮(0、０5％～9５％)
重现性:1％相对误差(包括消化步骤)ﻫ回收率:9９。5%－100％(1～200mg氮)
耗能:80０W
外形尺寸:３８0＊3３0*750ﻫ重量(ＫG):26
(可根据需要搭配消化炉)