PCR扩增目的基因.ppt

PCR扩增目的基因1一、实验目的1、掌握PCR扩增DNA的技术与原理2、学习PCR扩增仪的使用2二、实验原理聚合酶链式反应是一种体外DNA扩增技术，具有灵敏度高、特异性强、操作简便和应用广泛等特点。PCR工作原理类似于DNA的体内复制过程，是将待扩增的DNA片段和与其两侧的已知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷酸作为引物，引物序列将决定扩增序列片段的特异性和片段长度。3标准的PCR过程分为三步：1.模板变性（92-96）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA 2.低温退火（37-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。3.延伸（72）：在Taq酶（在72左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5端3 端延伸，合成与模板互补的DNA链。45三、实验仪器PCR扩增仪台式高速离心机移液器高压灭菌后的Eppendorf管（0.5mL）电泳仪6四、材料与试剂 1、模板DNA（0.1g/L）：用牙签挑取单 菌落悬浮到50L的裂解液中（1%TritonX-100，20mmol/LTris-HCLpH8.2，2mmol/L EDTA），95温浴10min，10000r/min 离心5min，取2L上清液用于总体积50L的PCR反应。72、TaqDNA聚合酶（5U/L），10扩增 缓冲液，dNTP（1mmol/L）：购买。3、引物（100pmol/L）：设计并合成与目的DNA两侧互补的引物。8大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点9五、实验操作1.准备PCR反应溶液（1）按序将如下成分混合置于Eppendorf管内a.10扩增缓冲液 10Lb.4dNTPs 8Lc.引物11Ld.引物2Le.模板DNA 1L（10ng）f.TaqDNA聚合酶L（2.5U）加水至终100L 10（2）手指轻弹Eppendorf管底部 离心2s（3）加石蜡油50L封住溶液表面112.PCR扩增反应加好样的Eppendorf管置于PCR扩增仪内变性：95 5min 951min退火：55 45s 延伸：72 1min 重复循环30次循环结束后72 延伸8min反应完毕，取样置-4 待用 123.结果观察 取样进行琼脂糖凝胶电泳 溴化乙锭（EB）染色 观察DNA条带高度灵敏的荧光染色剂染色效果好操作方便稳定性差 强致癌剂 中度毒性 13六、注意事项1、PCR结果若出现非特异性的扩增条带，有 必要进一步优化反应条件，包括改变退火 温度和时间，调整Mg2+浓度等。2、PCR反应特异性强，引物浓度、TaqDNA聚合酶和dNTP的量不宜过多。3、引物设计要合理。Thank you!14再 见！15