技术大学课件.pptx
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1、技术大学课件PCRPCR技术产生得历史背景技术产生得历史背景19711971年年,KhoranaKhorana等人就提出了利用等人就提出了利用PCRPCR在体外扩增在体外扩增DNADNA得概念得概念;Saiki(1985)Saiki(1985)和和Mullis(1986)Mullis(1986)两家研究室分别用改两家研究室分别用改进得进得KleppeKleppe法获得了大量染色体法获得了大量染色体DNADNA单拷贝基因单拷贝基因;19881988年年,ChienChien从水生栖热菌从水生栖热菌(Thermus aquaticus)Thermus aquaticus)中分离出耐热中分离出耐热D
2、NADNA聚合酶聚合酶,简称简称Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶;MullisMullis正式确定了体外扩增正式确定了体外扩增DNADNA技术技术,1987,1987年获得年获得专利专利,命名为命名为Polymerase Chain Reaction(PCR)。PCR反应得基本过程反应得基本过程 PCR PCR由变性由变性-退火退火-延伸三个基本反应步延伸三个基本反应步骤构成骤构成:变性变性(denaturation)(denaturation)将模板将模板DNADNA置于置于92929696处理处理,使使dsDNAdsDNA链链解开成为解开成为ssDNAssDNA,以便她与引物结合以
3、便她与引物结合、PCR反应得基本过程反应得基本过程 退火退火(annealing)(annealing)模板模板DNADNA经加热变性成单链后经加热变性成单链后,温度降至温度降至5555左右左右,引物与模板引物与模板DNADNA单链得互补序列配单链得互补序列配对结合成局部双链对结合成局部双链;PCR反应得基本过程反应得基本过程 延伸延伸 DNA DNA模板模板-引物结合物在引物结合物在Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶得催化作用下得催化作用下,以以dNTPdNTP为反应原料为反应原料,按碱基配按碱基配对与半保留复制原理对与半保留复制原理,引物沿引物沿5353方向延方向延伸伸,最终合成一条
4、新得与模板最终合成一条新得与模板DNADNA链互补得链互补得DNADNA链。链。PCR反应得基本要素反应得基本要素 模板模板DNADNATaqTaq酶酶dNTPdNTP引物引物MgMg2+2+Template DNA模模板板DNADNA得得数数量量与与纯纯度度,就就是是PCRPCR成成败败与与否否得得关关键键环环节节之之一一。但但不不同同类类型型PCRPCR反反应应对对模模板板DNADNA数量与纯度得要求不同。数量与纯度得要求不同。数量数量:3 310106 6个拷贝个拷贝 酵母菌酵母菌 10ng10ng 细菌细菌 1ng 1ng 质粒质粒 1pg1pg 纯度纯度:RAPD OD:RAPD O
5、D260260/OD/OD280280=1=1、6 61 1、9 9 AFLP OD AFLP OD260260/OD/OD280280=1=1、7 71 1、8 8 DNA Polymerase Taq DNA Polymerase 来源来源:古细菌嗜热水生菌古细菌嗜热水生菌(thermus aquaticusthermus aquaticus)特点特点:耐耐高高温温,在在7070下下反反应应2 2 h h后后其其残残留留活活性性大大于于90%,90%,在在9595下反应下反应2 2 h h后为后为40%;40%;在在热热变变性性时时不不会会被被钝钝化化,不不必必在在每每次次扩扩增增反反应应
6、后后再加新酶再加新酶;大大大大提提高高了了扩扩增增片片段段特特异异性性和和扩扩增增效效率率,增增加加了了扩增长度扩增长度(2(2、0 0 kb);kb);具具有有5353外外切切酶酶活活性性,但但无无3535外外切切酶酶活性活性,因而对某些单核苷酸错配无校正功能。因而对某些单核苷酸错配无校正功能。大家有疑问的,可以询问和交流大家有疑问的,可以询问和交流可以互相讨论下,但要小声点可以互相讨论下,但要小声点可以互相讨论下,但要小声点可以互相讨论下,但要小声点 pfu DNA Polymerase 来来源源:就就是是从从Pyrococcus Pyrococcus furiosisfuriosis 中
7、中精精制制而而成成得得高保真耐高温高保真耐高温DNADNA聚合酶。聚合酶。特点特点:她她不不具具有有5353外外切切酶酶活活性性,但但具具有有3535外外切切酶酶活活性性,因因而而可可纠纠正正PCR PCR 过过程程中中产产生生得得错错误误,使产物得碱基错配率极低使产物得碱基错配率极低;PCRPCR产产物物为为平平端端,无无33端端突突出出得得单单A A核核苷苷酸酸,不不能能进行进行T-AT-A克隆。克隆。Vent DNA Polymerase 来来源源:从从嗜嗜热热高高温温球球菌菌(Thermococcus(Thermococcus LitoralisLitoralis)中分离出得。中分离出
8、得。特点特点:不不具具有有5353外外切切酶酶活活性性,但但具具有有3535外外切切酶酶活活性性,可可以以去去除除33错错配配得得碱碱基基,具具有有校校对对功功能能;PCRPCR产产物物为为平平端端,无无33端端突突出出得得单单A A核核苷苷酸酸,不不能能进行进行T-AT-A克隆克隆;PCRPCR产物得扩增长度可达产物得扩增长度可达1010kbkb以上。以上。primers 随随机机引引物物:引引物物为为随随机机设设计计得得短短序序列列,通通常常为为1010bpbp左左右右,扩扩增增产产物物得得非非特特异异性性高高,易易受受扩增条件影响扩增条件影响;特特异异引引物物:引引物物根根据据特特定定得
9、得DNADNA序序列列设设计计而而成成,扩增产物得特异性强扩增产物得特异性强;简简并并引引物物:就就是是根根据据密密码码子子得得简简并并性性原原则则,以以蛋蛋白白质质序序列列中中得得氨氨基基酸酸保保守守区区反反向向设设计计而成得而成得,扩增产物得特异性比较强。扩增产物得特异性比较强。InsuF 5-AATCAGCACCTATGTGGTTCTCAYYTNGTNGA-3 InsuR 5-GCTGGTACAGAGAGCAGATGGAAKYRCARCAYTG-3 其中其中 Y=C/T N=A/T/C/G K=G/T R=A/G 简并引物简并引物 PCR反应体系得基本成分反应体系得基本成分 1010PC
10、RPCR Buffer Buffer MgClMgCl2 2或或MgSOMgSO4 4 dNTPdNTP Mixture(dATP,dTTP,dCTP,dGTP)Mixture(dATP,dTTP,dCTP,dGTP)引物引物(随机引物或特异引物随机引物或特异引物)模板模板DNA DNA Taq DNATaq DNA polymerase polymerase ddHddH2 2O O 常规常规PCR反应体系反应体系10PCR Buffer 2、5ulMgCl2(25mM)2、0ul dNTP(10mM)0、2ul Forward primer(10uM)1、0ul Reverse prime
11、r(10uM)1、0ul 模板模板DNA 50ng Taq酶酶(5U/ul)0、2ul ddH2O to 25ulPCR引物设计得基本原则引物设计得基本原则 合理得设计可在扩增得特异性和有效性之间找到一个平衡点。1 引物长度通常1830bp;2 解链温度(Tm);Tm=4(G+C)+2(A+T)3 GC含量以40%60%为宜,GC太少扩增效果不佳,G+C过多易出现非特异条带;PCR引物设计得基本原则引物设计得基本原则 4 ATGC最好随机分布,避免5个以上得嘌呤或嘧啶核苷酸得成串排列;5 避免引物内部出现二级结构,以及避免两条引物间互补,特别就是3端得互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异得扩
12、增条带;6 引物3端得碱基,特别就是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败;7 引物中有或能加上合适得酶切位点,被扩增得靶序列最好有适宜得酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处;8 引物得特异性:引物应与核酸序列数据库得其她序列无明显同源性。361 AAGGTATCACTAGAATGGCTATTAGCATTGGGTCCAAGCTTAGGAATTGCTCGAGTACCG361 AAGGTATCACTAGAATGGCTATTAGCATTGGGTCCAAGCTTAGGAATTGCTCGAGTACCG 421 GGTATTGGTTTAGTTTTTACCGATCT
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