组织化学概况.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,组织化学技术,本次课掌握内容,组织化学技术的定义,组织化学技术的发展,组织化学技术的原理,组织化学技术的基本要求,组织化学技术是一门怎么样的课程？学习什么样的技术？主要用处是什么？,调 查 题,1、组织学、显微技术中观察的,切片,是如何制作的？,2、组织学的切片能观察到什么？如何观察细胞组织中特定的化学对象？,组织化学的定义,组织化学（histochemistry）又叫细胞化学（cytochemistry）、显微化学,即在,不破坏细胞形态结构,的状况下，是运用化学、物理等技术手段对组织与细胞的,化学成分,、,化学反应,，及其,变化规律,进行,定位、定性,和,定量,研究的科学。,生物化学与组织化学,生物化学一方面是进行细胞组成成分的化学分析，另一方面是对这些成分化学反应的分析,是,组织化学反应原理的基础。,前者是提取于,体外或细胞外,研究，主要在试管中进行；,后者是在,原位,进行研究，在切片或细胞涂片上进行研究。,注 意,1、组织化学的结果需要用,显微镜,才能观察到。,2、组织化学看到的,不是化学物质本身,，而是该物质经过化学反应后的产物,3、该产物的位置和数量可以代表该化学物质的位置和数量,免疫学,与组织化学,：将抗原、抗体的特异性与组织化学的可见性巧妙的结合起来，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质。,分子生物学,与组织化学,：将碱基配对的分子杂交原理与组织化学相结合，产生了在核酸原有位置上进行的细胞内核酸定性、定位。,以上两学科的发展，,推动了组织化学,的进步，扩展的传统意义上的组织化学内涵，形成了多个分支。,组织化学的发展简史建立,从1664年，Robert Hooke发现细胞起，细胞学和组织学开始建立和发展。,把化学技术与显微镜结合起来，应归于法国植物学家,Raspail,（,拉斯帕伊,1826）,组织化学的发展简史建立,Raspail：,在研究植物的受精作用时，首次发现,碘对淀粉的反应,蛋白质的黄色反应,硫酸对于蛋白质醛基和糖醛基的显色反应,利用指示剂显色测定细胞原生质的pH值,1830年Raspail发表了在生理学中使用显微镜观察化学物质的论著，从此,标志着组织化学技术的开端,，,Raspail也因此被认为是组织化学技术的创始者,Vogel(1845年)和Perls(1867年)分别用硫化物和普鲁士蓝法显示,铁,；,Millon的米伦法显示,蛋白质,(1849年)；,Bencke(1862年)将,甲苯胺蓝,等苯胺染料用于组织学研究（苯胺染料技术发展到高峰的20世纪40年代才活跃起来）,Heidenhain发现细胞的嗜铬反应(1870年)；,Miescher用,甲基绿,显示细胞核的,染色质,(1873年)；,Weigert(1884年)和Marchi(1892年)提出,髓鞘染色法,；,Daddi(1896年)首次应用苏丹(sudan m)进行离体,脂肪染色,；,Klebs(1868年)和Stuve(1872年)的,过氧化物酶显示法,：,Ehrlich(1885年)发现,细胞色素氧化酶,。,Mann自1902年起，逐渐建立了完善的,组织冷冻切片技术,。,弥补了一般化学固定及石蜡包埋的缺点，可防止酶活性丧失。脂类、多糖类和无机盐的丢失等，推动了脂类、黏多糖及酶组织化学研究的发展。,这些都有力的支持了化学染色理论。,但是由于,化学知识的贫乏和显微镜技术的停滞,在一定时期限制了组织化学作为一个学科的发展。,直到20世纪30年代组织化学才复兴,1908年Macallum的组织化学的方法和结果,1929年Hertwig的组织化学方法,1949年Glick的组织化学和细胞化学技术,1954年Pearse的组织化学理论与应用,组织化学的发展,蛋白质和氨基酸：,四氮盐反应、精氨酸显色法、巯基反应，银浸法等,核酸：,Feulgen-Schiff反应、甲基绿-派若宁反应,糖类：,PAS反应等,脂类：,苏丹系列、油红等,组织化学的发展,1939年是,酶组织化学,划时代的一年,高松英雄和Gomori于1939年同时发表证明了,碱性磷酸酶,的组织化学方法。,继而证明了磷酰胺酶、ATP酶、酸性磷酸酶、脂酶、酯酶等组织化学法。,随即创立了金属盐法、偶氮色素法,1955年H.Scheldon和D.Brandes等人把电镜与酶组织化学结合起来，以金属沉淀法观察了酸性磷酸酶和碱性磷酸酶，奠定了,电镜酶组织化学基础,。,后来Seligman(1967)提出,锇黑化法,进一步阐述了电镜组织化学的基本原理和反应过程。,使组织化学的定位进入到了亚细胞水平。,Coons等（1950）为了在荧光显微镜下能够对酶进行观察，提出了,荧光抗体法，,从而把免疫学引入组织化学实验中。,Nakane等以辣根过氧化物酶为标记物的,酶标抗体法,为组织化学开辟了新的途径,酶标法,。,1969年人们把,分子杂交技术应用到组织切片和细胞标本,上，开始探索,原位杂交技术,近20年来，多种亲和物质的发现，如：植物凝集素糖结合物，生物素卵白素（亲和素），不但与亲和物质之间有高度的亲和力，而且可以和标记物，如荧光、酶、放射性物质等结合，1976年，开创了,亲和细胞化学技术。,发展比较快的是,定量细胞化学及定量组织化学,。其目的是对细胞、细胞的组分和细胞外的产物，在其原位上和活的情况下进行定量化学分析,如：吸收量度法、荧光测定法、干涉量度法、反射量度法、原位定量测定、放射自显影,Gomori（1952）认为组织化学是个混合学科，即组织学、细胞学、生物化学、免疫学等之间的边缘领域,故定义为,：,在组织和细胞中，以化学或物理实验法，对其某些特殊物质、反应基团和酶促活性进行识别、定位和定量。,组织化学的研究内容,1、无机物质：各种金属元素和微量元素以及盐类,2、有机物质：糖类、脂类、氨基酸、核酸、蛋白质、色素、维生素等。,3、各种酶类：目前能显示的200多种,4、各种抗原和抗体,5、内源性或外源性基因片段,组织化学分支,无机组织化学,糖组织化学,酶组织化学,电镜组织化学,荧光组织化学、,免疫组织化学,同工酶组织化学,定量组织化学,原位杂交组织化学等,我国组织化学发展概况,开始于20世纪50年代,领军人物:,李肇特、张作干、汪堃仁,李肇特：,19132006，北京大学医学部组织学与胚胎学教授，60年代建立组织化学实验室，率先在全国推广组织化学技术。,我国组织化学发展概况,张作干:,1906-1969,浙江人。协和医科大学和中国医学科学院实验医学研究所形态学教授。利用组织化学方法及电镜，观察小白鼠胚胎发生过程中各器官组织的组织化学及超微结构变化,从1953年起进行组织化学研究工作，培养了一大批研究生，并设计出了我国第一台,恒冷箱切片机,，对普及组织化学新技术作出了卓越贡献,我国组织化学发展概况,汪堃仁:,19121993,安徽人。中国科学院院士，北京师范大学生理学、细胞学教授。著有酶的组织化学，把生化、组织化学和生理功能结合起来进行研究，对生理学和细胞学的研究有重要的推动作用。,在消化生理、组织化学和肿瘤细胞生物学研究方面作出了显著的成绩,我国组织化学发展概况,1988年3月，中国解剖学会下成立了,“组织化学与细胞化学学组,”，发行了,中国组织化学与细胞化学杂志,国际组织化学与细胞化学学会联合会，1960年成立，我国在1980年首次参会。,张保真、王启民、马仲魁、艾民康等,组织化学基本原理,应用已知的物理、化学反应过程使组织细胞内的各种化学物质在原位形成可见的有色反应终产物。,组织化学基本原理,1、化学反应,通过已知的化学反应，在切片上生成有色沉淀以显示其化学成分及其定位。,大多数组织化学方法属于此类，如酶组织化学,组织化学基本原理,2、类化学反应,少数组织化学方法的染色结果有特异性，但其机制不明,如卡红显示糖原、,Best胭脂红显示糖原；Mayer胭脂红显示糖蛋白,组织化学基本原理,3、物理学原理,运用物质的,物理学特性,来显示其存在,如,苏丹脂类,；单胺类经甲醛诱发可产生荧光；组织X射线显微分析法，放射自显影，显微烧灰法等。,组织化学基本原理,4、生物学特性,利用生物大分子物质有抗原性的特性，用荧光色素、酶、胶体金等标记,免疫组化、亲和组化,组织化学基本原理,5、核苷酸互补原理,两条互补的核苷酸链可聚合形成稳定的杂交体,原位杂交技术,要求的基础,组织学、细胞学,显微技术,生物化学,分子生物学,物理学,组织化学技术的基本要求,1具有高度的特异性,才能鉴别所显示物质的类属，正确分析实验,2具有一定的敏感性,显示含量极微的物质，并弥补组织制备过程中化学物质及酶活性的丢失。,3尽可能地保持组织和细胞生前的形态结构、化学成分和酶的活性。,为此必须选择适当的固定液和恰当的处理方法，如冷冻干燥、冰冻替代、恒冷箱切片、振动切片等。,4化学反应要求在细胞或组织内进行，,须有定位的准确性,。,为此必须控制反应的时间和条件，使反应的产物不易位、不弥散。,5反应产物须有显色性和定量的可能性,即必须是有颜色的沉淀或结晶或具有一定的电子密度。,沉淀颗粒细小连续、色深、不溶，稳定，并能保留在原位上。颜色深度要与物质含量或酶的活性具有一定的比例关系。,6反应要有,对照,，以利于判断其结果的可靠性。阴性对照和阳性对照。,7、要具有,重复性。,1、必须掌握被检测物质的物理性质和化学特性：水溶性、脂溶性、溶解度、特异反应等,2、掌握该物质在组织细胞内的分布、定位,3、使用试剂为分析纯，所用器皿清洁、无污染，使用的水为双蒸水。,注意事项,本学期的主要内容,1理论知识主要内容：30学时,组织化学概述,组织化学标本的制备,光镜组织化学,电镜组织化学,酶组织化学,免疫组织化学,原位杂交组织化学,定量组织化学,实验方案设计和讨论,2实验内容（30学时）,光镜组织化学样品的制备方法,组织切片技术,常规组织学染色技术（HE）,多糖光镜组织化学技术（PAS）,核酸光镜组织化学技术（Feulgen；AO）,酶光镜组织化学技术,免疫组织化学技术,实验安排,1、分组：6个组，确定组长,2、设计实验方案,3、讨论实验方案（分组讲述）,4、试剂的配制,以上步骤在实验开始前进行,5、实验操作的进行,课程考核,校考课,实验：40%（实验操作20%+实验报告20%）,理论：60%（笔试）,预习：光镜组织化学标本的制备,思考：,组织学,标本制备和,组织化学,标本制备有什么区别？,