生物技术与中药质量控制.ppt

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中药质量控制的生物技术,中药材病虫害防治,种质资源,中药材鉴定,中药生产,中药质量监测,天敌,保护自然天敌、人工饲养和散放天敌、引进外地有效天敌,昆虫的性信息素,昆虫信息素与不育性的利用是生物防治的新手段，包括利用害虫的性引诱信息素进行诱捕、迷向或者交配干涉防治，利用蚜虫的报警信息素来趋避蚜虫，利用不育雄虫进行交配使害虫后代不育等多种方法。,培育及选用抗病虫品种,利用弱致病力菌株对中药材进行保护，利用外源物质诱导药材的抗病性或抗虫性增强，利用药材的抗病、抗虫品种减轻病虫的危害等方法都可以防止或减少病虫害的发生。,生物农药等,包括应用活体微生物制剂和生物的代谢产物两大类。例如枯草芽孢杆菌就是一种理想的微生物杀菌剂。,1中药材病虫害防治方面,澳大利亚三部曲控制“新娘藤”,“新娘藤”当时是作为一种园林植物从南非引进的，后来进入大自然，成为澳大利亚南部未开垦的森林地带中最危险的杂草，在那里，“新娘藤”的茎和叶子攀援到其他的植物上生长，使得大量的当地植物因缺乏阳光、空气和水分窒息而死。像大部分的入侵植物一样，“新娘藤”的种子可以在没有松土的土壤里发芽，所以这种杂草就比其他草传播蔓延得更快，尤其在没有干涉的自然环境中，比如自然保护区中，从而引起生态变化。澳大利亚联邦科学与工业研究组织的生态学家斯科特说：“由于是在自然保护区里，化学药物是被禁止使用的，所以我们惟一的选择就是用生物控制法对其进行控制。”,第一部：释放叶蝉,澳大利亚进行的第一种生物控制就是用“新娘藤”叶蝉来对付这种植物，1999年至2003年，澳大利亚政府释放了许多叶蝉，这是一种只有2毫米长的昆虫，吸吮“新娘藤”进行光合作用的叶细胞，所以“新娘藤”的传播速度得到了有效的抑制。,第二部：释放铁锈菌,2000年，澳大利亚政府又批准释放一种铁锈菌，这种菌能够在“新娘藤”的叶子和茎上生长，吸收“新娘藤”生长和繁殖所需的养分。,第三部：释放甲虫,2002年，澳大利亚政府又释放“新娘藤”叶甲虫，这种甲虫的幼虫专门吃“新娘藤”的小芽和叶子，从而有效地阻止了“新娘藤”向新的地区攀爬蔓延。据悉，澳大利亚有1000多家公司合力实施这一生物控制计划，它们帮助培养和释放“新娘藤”,天敌引入弊大于利,一是因为引进的天敌除对入侵生物有控制作用外，也对当地其他物种造成破坏。在当地环境中，如果没有与之相抗衡或制约它的生物，这个引进物种可能成为了真正的入侵者，打破平衡，改变或破坏当地的生态环境。,二是因为一对一的天敌太少，从生物学角度说，像薇苷菊，它没有固定的一种天敌，而是有近百种的天敌。引入一种或几种后，并不能对控制薇苷菊产生好的效果。,三是生态系统是经过长期进化形成的，系统中的物种经过上百年、上千年的竞争、排斥、适应和互利互助，才形成了相互依赖又互相制约的密切关系，物种间相互制约的关系非常复杂，这种复杂的关系不能靠引入天敌来解决,引进昆虫性信息素 开展水稻重大害虫监测,药用植物种质资源,是指含有生物活性成分，用于防病和治病的植物种质资源，包括人工栽培的药用植物资源。,生物技术在种质资源方面的应用主要表现在中,药材的品种改良,和,优良品种的选育,方面。,药材的种子质量是影响中药质量的源头问题，所以获得优良的中药材品种是保证中药材质量的首要和本质问题，控制中药材的质量首先要从,改良品种及培育优良品种,着手，主要通过以下几方面：,2种质资源方面,单倍体育种,单倍体育种：,是通过单倍体形成纯系的植物育种方法,。,-缩短年限，简化育种手续,多倍体育种,多倍体育种：,是利用人工诱变或自然变异，通过细胞染色体加倍获得多倍体育种材料，用以选育作物新品种的技术。,-,抗逆性强，药用成分含量高,胚乳培养：,将胚乳从母体上分离出来，放在无菌的人工环境条件下使其进一步生长发育形成幼苗的技术。,DNA分子标记辅助育种技术:,分子标记辅助育种是指通过在分子水平上分析与目标基因紧密连锁的分子标记的基因型来叛变目标基因是否存在和对其进行间接选择的一种育种方法。其基本原理是利用与目标基因紧密连锁或表现共分离关系的分子标记对选择个体进行目标区域以及全基因组筛选，从而减少连锁累赘，获得期望的个体，达到提高育种效率的目的。,基因工程育种:,是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。,基因工程育种(转基因育种)研究始于20世纪70年代。在以基因突变和有性杂交研究的基础上,拓宽了植物可利用的基因库。采用分子生物学和基因工程技术将外源基因有目的、有计划地插入、整合到事先准备好的受体作物基因组中,使其在受体中得以表达和遗传,从而使受体植物获得新的性状,培育出新的优良品种。,转基因工程技术已成为当今作物遗传育种、改良品种体系的重要途径之一,主要集中在,性状改良、增加抗性,等方面,其研究成果和应用前景倍受重视。,抗虫基因工程育种,我国2002年11月14日颁布的中药现代化发展纲要把中药资源保护和可持续利用作为重要的内容，指出要“,加强中药材新品种培育，开展珍稀濒危中药资源的替代品研究，确保中药可持续发展,。”,三七为二倍体(2n=2x=24)植物，有别于四倍体的人参和西洋参。,二是因为一对一的天敌太少，从生物学角度说，像薇苷菊，它没有固定的一种天敌，而是有近百种的天敌。,我国红景天属植物较多，但是各种红景天传统鉴定研究并不多，目前，做过鉴定研究的有大花红景天、高山红景天、狭叶红景天、菱叶红景天、长鞭红景天、蔷薇红景天等。,传统名贵菌类中药冬虫夏草的发酵产品已工业化生产，并逐步走向国际市场。,举例：不同品种红景天药材的鉴定研究进展,细菌内毒素是革兰氏阴性菌死亡后释放的脂多糖大分子，是其细胞壁的组成成分，细菌内毒素进入人体超过一定限量后会发生热原反应，引起病人发烧，严重的会造成死亡。,二是因为一对一的天敌太少，从生物学角度说，像薇苷菊，它没有固定的一种天敌，而是有近百种的天敌。,一旦选择到性状优异的个体或品系，可以通过组织培养，加快繁殖，扩大群体，供品系比较试验或生产示范试验，甚至应用于新品种的扩大生产规模。,胚乳培养：将胚乳从母体上分离出来，放在无菌的人工环境条件下使其进一步生长发育形成幼苗的技术。,但实践证明，丸剂的溶散与丸粒表面的润湿性、毛细管作用、膨胀作用及溶化作用等密切相关，泛制丸在成型过程中粉粒相互堆积，形成许多毛细管和孔隙，这是丸剂干燥时水分外泄的通道，也是溶散时水分向丸内渗透的主要通道。,2、现代色谱用于中药鉴定，为中药鉴定开辟了一条新思路。,3分子与探针的杂交受限制,三七品种遗传改良研究的策略,三七作为人参属植物中的珍贵中药材，开展品种遗传改良，培育新品种是云南省三七科技产业发展的迫切要求，也是为三七实施GAP种植、生产高质量药材，为国内外相关医药企业提供优质原料的需要。然而，由于三七生态适应性差、地理分布窄，生长周期长、繁殖系数低、种子寿命短，加之从事三七基础研究的技术人员少等原因，三七遗传改良工作才刚刚起步，许多问题有待于研究解决。,策略一、加强三七种质资源的基础研究,1、扩大种质资源库,2、种质资源的整理和评价,对所有的种质材料进行系统的种质资源学整理、评价和研究，明确其在三七遗传育种、生物技术开发等方面的利用价值，为保护和发掘我国中药材资源、加快三七产业的发展提供理论依据及技术支持，并力图筛选出优良变异类型。,策略二、三七常规育种方法的建立,1、系统育种方法,由于三七生长周期长(23年结果)、繁殖系数低、种子寿命短。三七常规育种工作难度大、周期长。故需要根据其生物学特性建立可行的育种方法。,2、杂交育种方法,目前，三七还没有一个真正的品种，无法开展品种间杂交育种。但有必要开展不同变异类型间的杂交，探索杂交育种的基本技术和规律，为以后工作打基础。种间远缘杂交育种：三七与人参属其他物种进行杂交的可能性是存在的。但三七是二倍体(2n=24)，与其杂交的近缘种以二倍体物种为宜。,策略三、现代生物技术在三七品种培育中的应用,1、组织培养体系,三七组织培养体系已基本建立。三七的愈伤组织诱导和培养的难度不大但再生苗的分化和成苗周期偏长，需2年以上的时间，如何缩短周期值得进一步研究。,组织培养技术在三七品种培育中的潜在的应用前景有如下几方面：,1)加快繁殖,一旦选择到性状优异的个体或品系，可以通过组织培养，加快繁殖，扩大群体，供品系比较试验或生产示范试验，甚至应用于新品种的扩大生产规模。,2)单倍体育种,人参花药培养已在l987年获得成功，并得到了单倍体,再生植株。三七的花药培育研究尚未见报道。开展花药培养研究的在三七育种上是有应用前景的。通过花培，可获得三七单倍体，再经人工或自然加倍成为纯合的二倍体，即所谓的单倍体育种。这一技术将可以减少有性世代，缩短育种周期。,2、多倍体育种,三七为二倍体(2n=2x=24)植物，有别于四倍体的人参和西洋参。增加染色体倍性，可能会增加植株的有效成分的含量。,3、转基因育种体系,三七的转基因育种还许多基础研究有待于开展。如高效的遗传转化体系、目的基因和配套的遗传元件、基因表达规律等等,。,4、分子标记辅助育种,指利用DNA分子标记如RFLP、RAPD、AP-PCR、SSR、AFLP技术，探讨三七育种性状与标记的相关性，为早期筛选优良个体提供鉴别指标提高选种效率，缩短育种周期，降低成本。,我国药材种类繁多，资源丰富，但,来源复杂，品种混淆严重,。目前一直运用经典形态分类来研究药材来源，这种方法得到的结论往往不完善，又容易引起争论。近年来，随着现代生物技术的发展，许多新学科、新理论和新实验技术不断渗透到中药鉴定领域。,3中药材鉴定方面,A电泳技术,-,蛋白质电泳、同工酶电泳、高效毛细管电泳,B免疫鉴别技术,-,特异性强,C细胞生物学技术,-,染色体分类技术,D分子生物学技术,1953年Watson和Crick提出了脱氧核糖核酸（DNA）的双螺旋结构模型，奠定了分子水平上研究生命现象的基础，近几十年来，分子生物学渗透到生命科学的各个领域，特别是医药学。在中药鉴定领域，也出现多种分子生物学鉴别方法，实践证明，该方法,取材少、结果准确，,克服了以往中药鉴定中的许多不足，具有其他方法难以比拟的优势。,1DNA分子标记法,-限制性（内切酶）片段长度多态性（RFLP）、聚合酶链式反应（PCR）和随机扩增的多态性DNA（RAPD）三种技术,。,2差异显示技术,-传统mRNA差异显示技术（DDRT-PCR)和限制性酶切片段差异展示技术（RFDD-PCR）。,E生物芯片技术,-生物芯片是将生命科学研究中涉及的不连续的分析过程（如样品制备、化学反应和分析检测），利用微电子、微机械、化学、物理技术、计算机技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统，使之连续化、集成化、微型化。,-四大要点：芯片方阵的构建、样品的制备、生物分子反应和信号的检测。,-基因芯片、蛋白质芯片、芯片实验室,虽然基因芯片技术近年来已经取得了长足的发展，但当前也存在一些亟待解决的问题，主要表现在以下几个方面：,1价格昂贵,2技术复杂,3分子与探针的杂交受限制,4检测灵敏度低,5基因芯片的特异性有待提高,举例：不同品种红景天药材的鉴定研究进展,红景天药用历史悠久，素有“,黄金人参,”“,神仙草,”之称。药理研究表明红景天属植物具有抗缺氧、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老、抗疲劳、增强记忆力等作用。我国红景天属植物来源复杂，商品药材种类多，但不同种类红景天疗效不尽相同，相似功效的种类由于药用成分及含量存在差异，品质也不一样，个别品种还含有有毒成分。为确保红景天药材的使用安全有效，对红景天药材的分类和正确鉴定就尤为重要。,1、传统研究中药,性状鉴定,和,显微鉴定,为中药鉴定的传统方法。,我国红景天属植物较多，但是各种红景天传统鉴定研究并不多，目前，做过鉴定研究的有大花红景天、高山红景天、狭叶红景天、菱叶红景天、长鞭红景天、蔷薇红景天等。原药材性状鉴定可以区分大部分红景天，但是蔷薇红景天和狭叶红景天之间区别并不十分明显，加之药材加工增加了性状鉴定的难度，因此显微鉴定是性状鉴定的必要补充。,2、现代,色谱,用于中药鉴定，为中药鉴定开辟了一条新思路。,传统鉴定方法在实际工作中，有一定的局限性，它需要具有一定的专业知识背景的科研人员，从某种程度上，不利于红景天药材的质量标准现代化。近年来，不少科研工作者将现代分析仪器和方法、技术运用到红景天药材的品种鉴别上，拓宽了红景天的鉴定研究范围。,薄层色谱、高效液相色谱、核磁共振谱,。,3、,分子生物技术,逐渐深入到中药鉴定领域。它的出现为中药品种鉴定提供了有效的手段。,有学者运用PCR产物直接测序法测定大花红景天与长鞭红景天、云南红景天等云南常见药用红景天及景天属的长丝景天的核糖体内转录间隔区序列并作同源性分析，序列比较的结果表明：红景天属样品的ITS序列与长丝景天有显著差别；红景天属内各种序列差异虽小，却存在显著而稳定的差别，从而准确鉴定出各种药用红景天植物。,红景天在清肺热、抗肿瘤、抗衰老、心血管方面的作用已经越来越引起人们的重视。对于红景天药材的鉴定研究，品种研究是其基础，因此有必要综合运用传统鉴定、色谱鉴定及分子生物技术对野生资源的种类、亲缘关系、分类地位、野生资源的生境、药材道地性等情况进行考察研究，并力求建立红景天属植物的种质资源库，保护有限的红景天资源。在此基础上，进行人工栽培、组织及细胞培养等工作，缓解野生资源日趋锐减的矛盾，并深入研究其化学成分及药理作用，在保证品质的基础上，扩大红景天的药用价值。,越来越多的实例证明，生物技术在中药生产方面的优势体现在：,极大的提高生产率,排除病菌和虫害的侵扰,严格控制药材质量,4中药生产方面,1细胞工程,目前细胞工程发展较为成熟，它在贵重、匮乏药材如人参、红豆杉、紫草、长春花等细胞培养和毛状根培养方面已获得成功，目前已接近工业化生产规模。杜仲、肉苁蓉等细胞培养工作正在进行研究中。,例如，中国药科大学进行了人参的10L体积大规模培养并对其培养细胞进行化学成分和药理活性比较分析，结果与种植人参无明显差异，目前已作为美容保健品投入市场，这也是我国中药生物技术产品第一个商品化的例子。,试管繁殖:,是一种微型的无性繁殖，它利用植物细胞的全能性，诱导器官分化，繁殖大量无性系试管苗，使植物种苗实现工业化生产。,在药材生产过程，试管苗快速繁殖技术是目前一项很成熟的技术，具有以下优点,：,-,繁殖量大、速度快、减少病虫害感染的概率；节约繁殖材料,2基因工程,近年来，基因工程在中药现代化研究方面得到迅速发展，它是研究中药作用机理方面有力的技术手段，如利用基因工程克隆植物催化酶，达到增加中药材有效成分含量的目的。提高青蒿素、紫杉醇等重要天然产物产量的基因工程技术正在研究中。基因工程在培养抗虫、抗病药用植物方面也起着重要作用。,3酶工程,-酶法提取中药活性成分,-提高中药活性成分含量,4发酵工程,-生产过程中严格要求无菌生长环境,。,吴勇志、林陆山运用生物工程技术发酵中药黄芪，经检测发酵的黄芪所含的黄芪多糖是普通煎、煮、熬水提法的0.3655.04倍。发酵中药只需正常提取所需材料量的1/28，即可与一般的煎、煮、熬水提物一份的量发挥同等功效。,我国菌类发酵工程也已取得重大成果。传统名贵菌类中药冬虫夏草的发酵产品已工业化生产，并逐步走向国际市场。,二是因为一对一的天敌太少，从生物学角度说，像薇苷菊，它没有固定的一种天敌，而是有近百种的天敌。,-生产过程中严格要求无菌生长环境。,像大部分的入侵植物一样，“新娘藤”的种子可以在没有松土的土壤里发芽，所以这种杂草就比其他草传播蔓延得更快，尤其在没有干涉的自然环境中，比如自然保护区中，从而引起生态变化。,3分子与探针的杂交受限制,澳大利亚联邦科学与工业研究组织的生态学家斯科特说：“由于是在自然保护区里，化学药物是被禁止使用的，所以我们惟一的选择就是用生物控制法对其进行控制。,指利用DNA分子标记如RFLP、RAPD、AP-PCR、SSR、AFLP技术，探讨三七育种性状与标记的相关性，为早期筛选优良个体提供鉴别指标提高选种效率，缩短育种周期，降低成本。,如高效的遗传转化体系、目的基因和配套的遗传元件、基因表达规律等等。,在此基础上，进行人工栽培、组织及细胞培养等工作，缓解野生资源日趋锐减的矛盾，并深入研究其化学成分及药理作用，在保证品质的基础上，扩大红景天的药用价值。,在药材生产过程，试管苗快速繁殖技术是目前一项很成熟的技术，具有以下优点：,策略三、现代生物技术在三七品种培育中的应用,生物技术在种质资源方面的应用主要表现在中药材的品种改良和优良品种的选育方面。,-酶法提取中药活性成分,澳大利亚三部曲控制“新娘藤”,在药材生产过程，试管苗快速繁殖技术是目前一项很成熟的技术，具有以下优点：,采用分子生物学和基因工程技术将外源基因有目的、有计划地插入、整合到事先准备好的受体作物基因组中,使其在受体中得以表达和遗传,从而使受体植物获得新的性状,培育出新的优良品种。,杜仲、肉苁蓉等细胞培养工作正在进行研究中。,三七的愈伤组织诱导和培养的难度不大但再生苗的分化和成苗周期偏长，需2年以上的时间，如何缩短周期值得进一步研究。,一般药品检验项目包括性状、理化特性、含量测定、常规检查（如片重、水分等）、特殊检查（如,崩解时限,、溶出度的测定）、卫生学检查（微生物限度检测、无菌检测）等。,5中药质量监测方面,中国药典2000年版规定，,水蜜丸,应在1小时内内全部溶散，而实际上溶散时限时常超标，因丸剂的溶散释药过程较复杂，作用机理还不十分清楚。但实践证明，丸剂的溶散与丸粒表面的润湿性、毛细管作用、膨胀作用及溶化作用等密切相关，泛制丸在成型过程中粉粒相互堆积，形成许多毛细管和孔隙，这是丸剂干燥时水分外泄的通道，也是溶散时水分向丸内渗透的主要通道。水蜜丸溶散过程中，丸粒表面的浸膏等粘性物质逐渐溶化，粉粒也随之分散于水中，由外而内溶化分散，此过程类似于中药浸膏片、半浸膏片的蚀解过程,。,中药注射剂还有一个特殊的检测项目-内毒素检测（BET),细菌内毒素是革兰氏阴性菌死亡后释放的脂多糖大分子，是其细胞壁的组成成分，细菌内毒素进入人体超过一定限量后会发生热原反应，引起病人发烧，严重的会造成死亡。所以，如今内毒素性疾病的研究逐渐得到重视和发展，对注射剂和人体内细菌内毒素的检测与治疗目前已经成为国际上医学界研究的热点问题，2000年巴黎国际内毒素大会讨论的重点议题就是如何准确检测人体细菌内毒素和治疗内毒素血症。,谢谢观看,谢谢观看,