中药中黄曲霉毒素的检测课件.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,精品文档,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,精品文档,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,精品文档,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,精品文档,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,精品文档,*,中药中黄曲霉毒素的测定,精品文档,目录,真菌毒素简介,黄曲霉毒素概述,黄曲霉毒素既有检测措施简介,黄曲霉毒素检测药典收载状况,药典检测措施详解,注意事项及试验室提议,精品文档,真菌毒素简介,真菌毒素：由产毒真菌在合适的环境条件下产生的有毒代谢产物，由真菌菌核产生。,Mycotoxin：源于希腊语（Mykes）和拉丁语（Toxicum）,精品文档,常见真菌毒素分类,精品文档,真菌毒素监控意义,真菌毒素对食品安全的危害,真菌毒素对种、养殖业的危害,真菌毒素对制药行业的危害（中药）,国际贸易中作为技术壁垒,在国际反恐和战争中，真菌毒素可作为大规模杀伤性生化武器,精品文档,黄曲霉毒素概述,黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉等菌种产生的次生代谢产物,精品文档,黄曲霉毒素的发现,1960年，在英国东南部某些农场中，有大概10万只火鸡不明原由地忽然死亡。,1961年发现火鸡饲料中混有的花生粉可以使大鼠诱发肝癌。,1962年，研究发现花生粉中具有一种荧光物质是导致。火鸡死亡的病因，这种荧光物质被证明为黄曲霉的代谢产物，故命名为“黄曲霉毒素(Aflatoxins)”。,精品文档,存在极其广泛,重要存在于土壤，动植物及多种坚果中。家庭自制发酵食品等也常常发现黄曲霉毒素。,一般在热带和亚热带地区，食品中黄曲霉毒素的检出率比较高。,未能及时晒干或储备不妥的粮食轻易产生，在农作物正常的生长期中也可以形成。,精品文档,毒性极强,1993,年黄曲霉毒素被世界卫生组织（,WHO,）的癌症研究机构（,IARC,）划定为,类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质，仅次肉毒毒素，是目前已知霉菌中毒性最强的。,急性毒性：比氰化钾大,10,倍，比砒霜大,68,倍,慢性毒性：肝脏损害，呈急性肝炎、出血性坏死、肝细胞脂肪变性和胆管增生。脾脏和胰脏也有轻度的病变。,精品文档,中药中轻易产生黄曲霉毒素的品种,种子、果实、粮谷类中药材,发酵类中药材,动物类中药材,油性成分多的中药材,含上述种类药材的中成药,精品文档,黄曲霉毒素的种类及性质,根据在紫外线照射下产生荧光颜色的不一样，分为B族和G族两大类及其衍生物,G,族,蓝色荧光,黄绿色荧光,精品文档,化学构造,基本构造：是一组化学构造类似的二呋喃香豆素的衍生化合物,目前发现约20余种，已分离鉴定出12种：B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q、H1、GM、B2a和毒醇。,B1：最常见、毒性及致癌性最强,精品文档,化学构造式,精品文档,理化性质,黄曲霉毒素相对分子量,312,346,难溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，但不溶于石油醚、己烷和乙醚,在中性及酸性溶液中较稳定，但在,pH,为,1,3,的强酸性溶液中稍有分解，在,pH,为,9,10,的,碱性溶液中分解迅速,精品文档,纯品为无色结晶,耐高温，黄曲霉毒素,B1,的分解温度为,268,紫外线对低浓度黄曲霉毒素有一定的破坏性,精品文档,黄曲霉毒素既有检测措施简介,薄层层析法：敏捷度低，定量困难,HPLC-紫外检测法：不衍生，敏捷度低，采用UPLC可以增强敏捷度,HPLC-荧光检测法：需衍生，敏捷度高,高效液相色谱-串联质谱法：不需衍生，敏捷度高，假阳性少，成本高,精品文档,免疫化学分析措施,酶联免疫吸附法：迅速、简便、单一毒素、假阳多,免疫亲和柱-荧光分光光度法：高效、无毒、假阳多,微柱筛选法：半定量，测总量,一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法：迅速、现场大批量初筛,精品文档,黄曲霉毒素检测药典收载状况,增补本附录,第一次增长了黄曲霉毒素测定法,一部,正文：僵蚕、陈皮、酸枣仁、桃仁、胖大海品种项下增长了黄曲霉毒素残留量检查,附录：继续收载了黄曲霉毒素测定法,精品文档,一部第二增补本修订了附录措施,删除了流速规定,增订了另一种衍生措施：即光化学衍生法,取消了免疫亲和柱的品牌规定,四部通则2351黄曲霉毒素测定法,增长了第二法：高效液相色谱-串联质谱法,增长附注：“当测定成果超过程度时，采用第二法进行确认”,精品文档,四部通则增长中药中真菌毒素测定指导原则,基本原则（中药中真菌毒素的分类、监控品种、测定措施、限值确定）,基本内容（高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联使用方法）,精品文档,四部通则9302 中药有害残留物限量制定指导原则中有关黄曲霉毒素的规定,“由于黄曲霉毒素毒性强，目前国际上不提议设定黄曲霉毒素的安全耐受量和无毒作用剂量，也无最大限量理论值计算公式，限量越低越好”。,精品文档,中国药典正文收载品种,根及根茎类：远志,果实种子类：大枣、肉豆蔻、决明子、麦芽、陈皮、使君子、柏子仁、胖大海、莲子、桃仁、槟郎、酸枣仁、薏苡仁,动物类：僵蚕、水蛭、地龙、全蝎、蜈蚣,共19种，较药典增长14种,精品文档,黄曲霉毒素药典检测措施详解,液相条件：,C18,，甲醇,-,乙腈,-,水（,40:18:42,）,衍生方式：,柱后碘衍生、柱后光化学衍生,混合对照品溶液的制备：,液体标液,（,B,1,B,2,G,1,G,2,=10.310.3 ug/ml,）梯度稀释,500,倍,精品文档,供试品溶液的制备：15g粉末，3gNaCl，70%甲醇提取，免疫亲和柱纯化,测定：吸取混合对照品溶液5l、10l、15l、20l、25l，注入色谱仪，绘制原则曲线。吸取供试品溶液20-25l，测定,精品文档,措施来源：中国药典四部通则2351黄曲霉毒素测定法,基本环节,提取,净化（活化、上样、洗杂、洗脱）,测定,随行质量控制（质控样、随行加样回收）,精品文档,泵流操作架,免疫亲和柱,HPLC-,荧光检测器,光化学衍生器,自动固相萃取仪,精品文档,净化环节,取,15ml,（离心后的提取液），加水至,50ml,滤过，取,20ml,，通过免疫亲和柱，,流速,3ml/min,加水洗涤两次，每次,10ml,过空气,10,秒，将水挤出柱子,分次加甲醇,1.5ml,，自然洗脱，过空气，定容至,2ml,精品文档,免疫亲和柱的原理,运用抗原抗体免疫反应的原理，使用大剂量的单克隆抗体，选择性的将样品提取液中的黄曲霉毒素吸附，用水将杂质洗脱除去，再用甲醇定量将黄曲霉毒素洗脱，到达分离净化目的,黄曲霉毒素,单克隆抗体,杂质,精品文档,黄曲霉毒素的衍生化,衍生原因,黄曲霉毒素,B,1,、,G,1,荧光遇水要淬灭,，检测前需要衍生化,精品文档,药典附录收载的两种衍生措施,碘衍生法：碘作为衍生剂，对衍生温度有规定，试剂对仪器有腐蚀性，需要冲洗,光化学衍生法：紫外光灯（254nm）照射，操作简朴，对衍生温度无规定，不需要其他衍生剂，无需冲洗,对黄曲霉毒素B1和G1进行衍生，黄曲霉毒素B2和G2不受该衍生环节的影响,精品文档,AFB,1,AFG,1,黄曲霉毒素的衍生化,精品文档,黄曲霉毒素的衍生化,精品文档,成果汇报,低于检测限（标出检测限）,汇报详细值,未检出,程度内,程度外,汇报详细值,精品文档,措施难点,痕量分析ppb级，规定高敏捷度,毒性强，具有一定的风险性安全防护措施,基质复杂,精品文档,注意事项,取样的代表性,黄曲霉毒素在样品中分布不均匀,免疫亲和柱的使用,储存、使用温度（使用阐明书）,安全防护,操作人员专门培训，全程穿工作服佩戴手套,注意事项及试验室提议,精品文档,对照品的使用,使用黄曲霉毒素混合对照品，不使用黄曲霉毒素固体纯品自行配置,对照品储备液避光、低温、密闭保留，工作液现配现用,精品文档,试验废弃物处理,残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，应泡在专用贮存容器（含10%次氯酸钠溶液内，浸泡24小时以上，再用清水将玻璃器皿冲洗洁净）,流动相单独搜集，先用次氯酸钠灭毒，再按常规处理,精品文档,试验室的提议,专门的仪器设备和场所,安全措施,废弃物,精品文档,谢谢！,精品文档,