遗传学的中心法则.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,遗传信息传递中心法则,转录,翻译,DNA RNA,蛋白质,反转录,复制,复制,第 十 章,DNA,的生物合成,(,复制,),DNA Biosynthesis,，,Replication,复制,(,replication),是指遗传物质的传代，以母链,DNA,为模板合成子链,DNA,的过程。,亲代,DNA,复制,子代,DNA,复制,分子基础：碱基配对规律和,DNA,双螺旋结构,化学本质：酶促的生物细胞内单核苷酸聚合,复制的保证：各种酶和蛋白质因子的参与,复制的基本规律,Basic Rules of DNA Replication,第一节,半保留复制,semi-conservative,replication,半不连续复制,semi-discontinuous,replication,复制方向为双向,bidirectional,replication,高保真性复制,high fidelity,复制的特点,一、半保留复制的实验依据和意义,DNA,生物合成时，母链,DNA,解开为两股单链，各自作为模板,(template),按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。,子代细胞的,DNA,，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的,DNA,都和亲代,DNA,碱基序列一致。这种复制方式称为,半保留复制,。,(,一）半保留复制的概念,（二）半保留复制的理论设想,T,G,G,T,A,C,T,G,C,C,A,C,T,G,G,A,C,C,A,T,G,A,C,G,G,T,G,A,C,C,T,G,G,T,A,C,T,G,C,C,A,C,T,G,G,A,C,C,A,T,G,A,C,G,G,T,G,A,C,C,C,C,A,C,T,G,G,G,G,T,G,A,C,C,T,G,G,T,A,C,T,G,A,C,C,A,T,G,A,C,A,C,C,A,T,G,A,C,T,G,G,T,A,C,T,G,T,G,G,T,A,C,T,G,C,C,A,C,T,G,G,A,C,C,A,T,G,A,C,G,G,T,G,A,C,C,+,母链,DNA,复制过程中形成的复制叉,子代,DNA,（三）子链继承母链遗传信息的几种可能方式,全,保,留,半,保,留,混,合,式,亲代,DNA,子代,DNA,（四）半保留复制的证明,实验,细菌可以利用,NH,4,Cl,作氮源合成,DNA,轻链,14,N-DNA,重链,15,N-DNA,轻、重链,DNA,混合,半保留复制,第一代,DNA,半保留复制,第二代,DNA,半保留复制,第三代,DNA,细菌在含,NH,4,Cl,的普通培养液中培养后提取,DNA,把细菌放在含,15,NH,4,Cl,的培养液中培养若干代后提取含,15,N,的,“,重,”,DNA,把含,15,N-DNA,的细菌放回含,NH,4,Cl,的普通培养液中培养,20,分钟后提取子一代,DNA,把含,15,N-DNA,的细菌在含,NH,4,Cl,的普通培养液中培养,40,分钟后提取子二代,DNA,将轻链,DNA,和重链,DNA,混合,把含,15,N-DNA,的细菌在含,NH,4,Cl,的普通培养液中培养,60,分钟后提取子三代,DNA,普通培养液培养细菌的轻链,DNA,在密度梯度离心时区带在离心管上方,子二代,DNA,密度梯度离心分析时有介于重带与轻带之间的中间带轻带两种,将轻链和重链,DNA,混合后密度梯度离心时在离心管中有与轻、重链对应的两条区带,子三代,DNA,密度梯度离心分析时仍有中间带和轻带两种，,以后各代,DNA,分子密度梯度离心结果相同，但轻带变浓而中间带逐渐被稀释。,含,15,NH,4,Cl,培养液培养的重链,DNA,在密度梯度离心时区带在离心管下方,子一代,DNA,密度梯度离心分析时致密带介于重带与轻带之间，没有单独的重带和轻带,实验结果说明,子一代,DNA,双链中,一股是,15,N,单链，从亲代接受和保留下来的；,另一股是,14,N,单链，完全是新合成的。,Messelson,和,Stahl,的实验支持半保留复制。,半保留复制的意义,按半保留复制方式，子代,DNA,与亲代,DNA,的,碱基序列一致,，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的,保守性,。,遗传的保守性是物种稳定性的分子基础，但,不是绝对的,。,在强调遗传恒定性的同时不能忽视其,变异性,。,二、双向复制,原核生物,DNA,复制时，,DNA,从,起始点,(origin),向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为,双向复制,。,复制中的放射自显影图像（眼睛状图形）,（大肠杆菌,DNA,经放射性标记后电镜下观察结果）,ter,A,环状双链,DNA,及复制起始点（,origin,）,B,复制中的两个复制叉（,replication fork,）,C,复制接近终止点,(termination,ter),复制叉,指的是,DNA,双链分成两股各自作为模板，子链沿模板延长形成的,Y,字形结构,复制叉,指的是,DNA,双链分成两股各自作为模板，子链沿模板延长形成的,Y,字形结构,E.coli,origin,真核生物,真核生物,有多个染色体均需要复制，每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。,习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个,复制子,(replicon),。,复制子是独立完成复制的功能单位。,高等生物有数以万计的复制子，长度差异很大。,原核生物是单复制子复制，称为复制体（,replisome,）。,真核生物的多复制子复制,5,3,ori,ori,ori,ori,5,3,5,5,3,3,5,5,3,3,复制子,已完成复制的复制子,DNA,母链，,ori,为复制点,复制子的大小和起始的先后不同,复制子长度为相邻起点间距离,其中一个复制子已经完成复制,复,制,进,程,三、复制的半不连续性,5,3,解链方向,3,5,领头链,(leading strand),随从链,(lagging strand),3,5,3,3,5,5,领头链连续复制，,随从链不连续复制，,这就是复制的半不连续性,DNA,的两股单链走向相反，一股为,5,至,3,，另一股（互补链）为,3,至,5,。复制叉上两股母链也是走向相反。,子链沿母链模板复制，只能从,5,向,3,延伸。,同一个复制叉上只能有一个解链方向。,顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为,领头链,。,另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为,随从链,。,冈崎片段,复制中的不连续片段称为,岡崎片段,(okazaki fragment),。,第二节,DNA,复制的酶学,The Enzymology of DNA Replication,参与,DNA,复制的物质,DNA,复,制系统,底物,dNTP,聚合酶,DNA-pol,模板,解成单链单链,的,DNA,母链,引物,与模板互补的,RNA,片段,其它酶,和蛋白质因子,底物,(,substrate,),:,d,ATP,dGTP,dCTP,dTTP,聚合酶,(polymerase):,依赖,DNA,的,DNA,聚合酶,简写 为,DNA-pol,模板,(template):,解开成单链的,DNA,母链,引物,(primer):,提供,3,-OH,末端使,dNTP,可以依次聚合,解螺旋酶,引物酶,单链,DNA,结合蛋白,DNA,连接酶等,一、复制的化学反应,单链延长的方向,单链延长的方向,(dNMP),n,+,dNTP (dNMP),n+1,+,PPi,新链生成需,引物,；,新链的延长只可沿,5,3,方向进行。,脱氧核糖核苷酸之间生成,3,，,5,磷酸二酯键而逐一聚合,二、,DNA,聚合酶,全称：,依赖,DNA,的,DNA,聚合酶,(DNA-dependent DNA polymerase),简称：,DNA-pol,活性（作用）有两方面：,5,3,的,聚合,活性，延,5,3,方向,延长脱氧核苷酸链。,核酸,外切,酶活性（两种情况）,3,5,外切酶活性，,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,5,3,外切酶活性，,能切除突变的,DNA,片段。,核酸外切酶活性,3,5,外切酶活性,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,5,3,外切酶活性能切除突变的,DNA,片段。,合成中的,DNA,分子,（一）原核生物的,DNA,聚合酶,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,三种酶共同点,：,都具有,5,3,聚合酶活性,3,5,外切酶活性,（二）真核生物的,DNA,聚合酶,真核生物,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,DNA-Pol,分子量,（,kD,）,5,3,聚合活性,3,5,外切活性,功能,16.5,40,14.0,12.5,25.5,中,起始引发,引物酶活性,-,+,？,高,高,高,+,+,-,低保真度的,复制,线粒体,DNA,的,复制,延长子链的,主要酶,解螺旋酶活性,填补引物空隙,切除修复,重组,三、复制保真性的酶学依据,复制按照碱基配对规律进行，使遗传信息能准确传代。,（二）复制的保真性,DNA,聚合酶对模板的依赖性是子链与母链准确配对、是遗传信息得以延续和传代的保证。碱基配对的关键是氢键的形成。,（三）聚合酶对碱基的选择,原核生物,DNA,聚合酶,III,对核苷酸的参入有选择功能。,复制保真性的酶学机制：,（一）,DNA-pol,有两种活性,聚合酶活性,核酸外切酶活性和即时校读,2.,聚合酶,在复制延长时,对碱基的选择功能,1.,遵守,严格的,碱基配对规律,3.,复制出错时,DNA-pol,的,及时校读功能,DNA,复制的,保真性,至少要依赖,三种机制,四、复制中的分子解链及,DNA,分子拓扑学变化,DNA,分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把,DNA,解成单链，它才能起模板作用。,（一）解螺旋酶、引物酶和单链,DNA,结合蛋白,（二）,DNA,拓扑异构酶,(DNA topoisomerase),拓扑异构酶作用特点,既能水解、又能连接磷酸二酯键,拓扑异构酶,拓扑异构酶,拓扑异构酶,拓扑异构酶,原,核,原,核,真,核,真,核,转轴酶,解缠酶,切口,-,封闭酶,松弛酶,蛋白,旋转酶,又分为,几种亚型,最近发现,曾用名,11,个,螺旋,9,个螺旋,被压缩,超螺旋局部解开后,DNA,复制过程中正超螺旋的形成,2,复制过程中正超螺旋的形成,超螺旋解开前,2,9,拓扑异构酶,切断,DNA,双链中,一股,链，使,DNA,解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，,DNA,变为松弛状态,。,反应,不需,ATP,。,拓扑异构酶,切断,DNA,分子,两股,链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。,利用,ATP,供能，连接断端，,DNA,分子进入负超螺旋状态。,拓扑异构酶的作用,五、,DNA,连接酶,DNA,连接酶,(DNA ligase),作用方式,连接,DNA,链,3,-OH,末端和相邻,DNA,链,5,-P,末端，使二者生成磷酸二酯键，把两段相邻的,DNA,链连接成一条完整的链。,DNA,连接酶,功能,在复制中起最后接合缺口的作用。,在,DNA,修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。,也是基因工程的重要工具酶之一。,第三节,DNA,生物合成过程,The Process of DNA Replication,（一）复制的起始,需要解决两个问题：,1,.,DNA,解开成单链，形成复制叉，提供模板。,2.,形成引发体并合成引物，提供,3,-OH,末端。,一、原核生物的,DNA,生物合成,E.coli,复制起始点,oriC,GATTNTTTATTT,GATCTNTTNTATT,GATCTCTTATTAG,1 13 17 29 32 44,TGTGGATTA-,-TTATACACA-,-,TTTGGATAA-,-,TTATCCACA,58 66 166 174 201 209 237 245,串联重复序列,识别区,反向重复序列,富含,AT,区,1,.,DNA,解链,5,3,5,3,解链过程,DnaA,、,B,、,C,三种蛋白参与,DnaB,解螺旋酶,DnaC,DnaA,蛋白,四个相同亚基组成,3,5,5,3,DnaB,解螺旋酶,DnaC,2,.,引发体和引物,Dna A,SSB,含有解螺旋酶、,DnaC,蛋白、引物酶和,DNA,复制起始区域的复合结构称为,引发体,。,DnaG,引物酶,DNA,拓扑,异构酶,3,5,5,3,DnaB,解螺旋酶,DnaC,SSB,DnaG,引物酶,DNA,拓扑,异构酶,合成引物,引物的合成,3,5,5,3,DnaB,解螺旋酶,DnaC,SSB,DNA,拓扑,异构酶,合成引物,DnaG,引物酶,解链方向,引物是由引物酶催化合成的短链,RNA,分子。,（二）复制的延长,复制的延长指在,DNA-pol,催化下，,dNTP,以,dNMP,的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,DnaG,SSB,SSB,SSB,DNA-Pol,前导链,后随链,-,冈崎片断,5,3,3,5,3,5,5,3,DnaB,解螺旋酶,5,3,5,3,随从链,领头链,3,3,5,5,3,5,复制的过程,-OH,ADP+Pi,ATP,DnaB.C,DnaG,形成引发体,5,3,5,3,解螺旋酶,拓扑异构酶,单链,DNA,结合蛋白,DNA-Pol,DNA,连接酶,原核生物基因是环状,DNA,，双向复制的复制片段在复制的终止点,(ter),处汇合。,（三）复制的终止,冈崎片断的连接,5,5,DNA Pol-,RNA,酶,水解,RNA,引物留下空隙,填补引物水解后留下的空隙，保留缺口,DNA,连接酶,DNA,连接酶,ATP,ADP+Pi,5,5,DNA,连接酶,5,5,P,形成磷酸二酯键连接片段之间缺口,二、真核生物的,DNA,生物合成,细胞周期（,Cell cycle,）,指细胞分裂的时相变化。,典型的细胞周期分为,4,期：,G,1,期（,DNA,合成前期）,S,期（细胞分裂的合成期），合成,DNA,G,2,期（,G2,期主要合成一些与有丝分裂中新细胞形成所必需的物质）,M,期（细胞染色体形成并发生细胞分裂，新细胞在此期形成）,体内活细胞周期长短相差悬殊，关键在,G,1,进入,S,期。营养良好的培养细胞周期约,24,小时。,真核生物,DNA,复制特点,不同染色体各自进行复制,每个染色体有上千个复制子，复制起点多,复制有时序性,复制子以分组方式激活而不是同步启动,转录活性高的,DNA,在,S,期早期就开始复制,卫星,DNA,（高度重复序列）、中心体（连接染色体双倍体的部位）、端粒（线性染色体两端）在,S,期最后复制,复制起始点比大肠杆菌起始点,OriC,短,复制起始需要,DNA-Pol,（引物酶）、,（解螺旋酶）、拓扑酶、复制因子（,replication factor,RF,）、增殖细胞核抗原（,proliferation cell nuclear antigen,PCNA,）参与。,（一）真核生物复制的起始,复制起始也是打开复制叉形成引发体并合成,RNA,引物，但详细机制不清楚。,细胞能否分裂，决定于进入,S,期及,M,期这两个关键点。,G1S,及,G2M,的调节，与蛋白激酶活性有关。,蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。,相关的蛋白激酶,具有四级结构的蛋白质，有两类亚基：,调节亚基,细胞周期蛋白（,cyclin,）,催化亚基,细胞周期蛋白依赖激酶（,cyclin dependent kinase,，,CDK,）,二者都有多种，而且可以交叉配伍，实现对,DNA,复制的多样化和精确的调节。,哺乳类动物细胞内还发现天然抑制,CDK,的蛋白：,锚蛋白（,ankynin,）,抑制,CDK4,P21,蛋白,抑制多种,CDK,，还抑制,PCNA,，还参加,P53,介导的细胞凋亡级联反应。,P21,和锚蛋白被称为,细胞检查点蛋白,。,3,领头链,随从链,引物,核小体,（二）真核生物复制的延长,当随从链延长了一个或多个核小体的长度后要重新合成引物,亲代,DNA,真核生物,DNA,复制与核小体组装同步进行，复制完成后随即组装成染色体并从,G,2,过渡到,M,期。,染色体,DNA,呈线状，复制在末端停止。,复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接都可以在线性,DNA,内部完成。,染色体两端,DNA,子链上最后复制的,RNA,引物，去除后留下空隙。剩下的,DNA,单链要填补成双链，否则会被核内的,DNase,水解变短。,（三）真核生物复制的终止,线性,DNA,复制的末端,复制完成后子链末端留下空隙，母链成单链,端粒,(telomere),指真核生物染色体线性,DNA,分子末端的结构。形态学上染色体,DNA,末端膨大成粒状。,结构特点,由末端单链,DNA,序列和蛋白质构成。,末端,DNA,序列是多次重复的富含,G,、,C,碱基的短 序列。仓鼠和人类端粒,DNA,末端都有（,TnGn,）,x,重复序列。,功能,维持染色体的稳定性,维持,DNA,复制的完整性,端粒酶,(telomerase),组成,端粒酶,RNA,(human telomerase RNA,hTR),端粒酶协同蛋白,(human telomerase associated protein 1,hTP1),端粒酶逆转录酶,(human telomerase reverse transcriptase,hTRT),功能,提供,RNA,模板、催化逆转录,端粒酶通过爬行模型的机制维持染色体的完整。,端粒酶的,RNA,端粒,DNA,末端,1,、端粒酶靠,hTR,（,AnCn,）,x,与母链,DNA,端粒结合,内在模板,RNA,2,、以端粒酶,RNA,为模版，逆转录，延长,DNA,母链,3,、端粒酶移位、空出,RNA,模板，再次延长母链，同时,DNA,母链反摺利于下游复制延伸。,端粒酶的,RNA,4,、延伸足够长度后端粒酶脱离母链，代之以,DNA-Pol,。此时母链,3,-OH,反折，同时作为引物和模板，完成末端双链复制。,端粒酶的,RNA,DNA-Pol,第四节,逆转录和其他复制方式,Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways,双链,DNA,是大多数生物的遗传物质。,某些病毒的遗传物质是,RNA,。,少数低等生物如,M13,噬菌体的感染型只含有单链,DNA,。,染色体外,DNA,（原核生物的质粒、真核生物的线粒体）都采用特殊的方式复制。,逆转录或反转录,(reverse transcription),逆转录酶,(reverse transcriptase),全称：依赖,RNA,的,DNA,聚合酶。,RNA,DNA,逆转录,酶,一、逆转录病毒和逆转录酶,信息流动方向,逆转录酶作用特点,逆转录酶具有三种酶活性：,以,RNA,作模板的,dNTP,聚合活性,以,RNA,作模板合成,DNA,单链，形成,RNA-DNA,杂化分子,RNase,活性,水解杂化分子中的,RNA,单链，生成,DNA,单链模板,（此作用可以由被感染细胞内,RNase,代替）,以,DNA,为模板的的,dNTP,聚合活性,DNA,作模板合成,DNA,单链，形成双链,DNA,分子,酶作用需要,Zn,2+,作为辅助因子,合成反应也按照,53,延长的规律,逆转录酶的存在：,致癌,RNA,病毒、蛙卵、白细胞、滋养层细胞。,逆转录酶的作用,逆转录酶,逆转录酶（,RNase H,）,逆转录酶,RNA,模板,DNA-RNA,杂化双链,单链,DNA,双链,DNA,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,3,5,逆转录病毒在细胞内的逆转录现象,dNTP PPi,H,2,O NMP,dNTP PPi,tRNA,引物,RNA,单链,模板,RNA-DNA,杂化双链,DNA,单链,DNA,双链,前病毒,与宿主基因组,DNA,整合,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为,cDNA,法。,以,mRNA,为模板，经逆转录合成的与,mRNA,碱基序列互补的,DNA,链。,试管内合成,cDNA,cDNA,complementary DNA,逆转录酶,SI,核酸酶,DNA,聚合酶,碱水解,AAAA,AAAA,TTTT,T,T,T,T,二、逆转录研究的意义,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。,逆转录现象说明：,至少在某些生物，,RNA,同样兼有遗传信息传代与表达功能。,对逆转录病毒的研究，拓宽了,20,世纪初已注意到的病毒致癌理论。,三、滚环复制和,D,环复制,滚环复制,(rolling circle replication),是某些低等生物的复制形式，如,X,174,和,M13,噬菌体等。不需要引物。,D,环复制,(D-loop replication),是线粒体,DNA(mitochondrial DNA,，,mtDNA),的复制形式。复制时需要合成引物。,第五节,DNA,损伤（突变）与修复,DNA Damage(Mutation)and Repair,遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为,突变,。,分子水平上的突变就是,DNA,上碱基的改变。,在复制过程中发生的,DNA,突变称为,DNA,损伤,(DNA damage),。,一、突变的意义,（一）突变是进化、分化的分子基础,（二）突变导致基因型改变,（三）突变导致死亡,（四）突变是某些疾病的发病基础,突变就其后果而言并非都是危害生命的，也有积极意义，且在生物界普遍存在。,二、引发突变的因素,物理因素,紫外线,(ultra violet,UV),、各种辐射,UV,可以导致,DNA,分子上相邻的两个嘧啶碱基发生共价交联，生成嘧啶二聚体（环丁基环,cyclobutane ring,）。,化学因素,很多的化学诱变剂同时就是致癌剂。,化学诱变剂的来源,（,1,）化工原料、化工产品、化工副产品,（,2,）工业排放物、汽车排放的废气,（,3,）农药、食品防腐剂或添加剂。,目前已经检出,6,万多种，而且每年增加超过千种。,（,4,）物质代谢过程中产生的自由基等因素能直接损伤,DNA,或干扰,DNA,的复制过程。,确定致癌物的检测方法,检测该物质是否对细菌有突变作用,（,Ames,试验）。,试验选用有缺陷的沙门菌：,（,1,）,His,：组氨酸异养型,必须加入组氨酸才生长。,（,2,）细胞壁缺陷：,化学物质易透入。,（,3,）修复系统不活化（缺陷）。,三、突变的分子改变类型,从化学本质看，突变的类型包括：,错配,(mismatch),重排,(rearrangement),缺失,(deletion),插入,(insertion),缺失和插入都有可能导致框移（,frame-shift,）突变。,（一）错配,DNA,分子上的碱基错配又称,点突变,(point mutation),。有两种类型：,1,.,转换：,发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。,2.,颠换：,发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。,如果点突变发生在基因编码区，则会导致氨基酸改变（蛋白质一级结构改变），进而影响该蛋白质的功能。,与疾病有关的点突变例子,镰型红细胞贫血,基因（编码链,G,A,GG,T,G,）,HbS=,2,2,6GluVal,（,链）,膀胱癌细胞,c-rasH,基因（编码链,G,G,CG,T,C,）,表达产物,12,位,GlyVal,。,（二）缺失、插入和框移,缺失：,一个碱基或一段核苷酸链从,DNA,大分子上消失。,插入：,原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到,DNA,大分子中间。,缺失或插入可导致,框移突变,框移突变,是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。,（三）重排,DNA,分子内较大片段的交换称重组或重排。,四、,DNA,损伤的修复,修复,(repairing,),是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。,修复的主要类型,光修复,(light repairing),重组修复,(recombination repairing),切除修复,(excision repairing),最重要、有效的方式,SOS,修复,（四）,SOS,修复,当,DNA,损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。,在,E.coli,，各种与修复有关的基因，组成一个称为,调节子,(regulon),的网络式调控系统。,这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过,SOS,修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而,DNA,保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。,