小片段基因组文库的构建.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验 小片段基因组文库的构建,基因文库,基因文库指某个生物的基因组,DNA,或,cDNA,片段与适当的载体在体外通过重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合。,根据文库所用的外源,DNA,的种类的不同,基因组文库,cDNA,文库,载体,把能携带外源,DNA,进入受体细胞的,DNA,分子,（,1,）在宿主细胞内能独立复制。,（,2,）有选择性标记。,（,3,）有一段多克隆位点。,外源,DNA,插入其中不影响载体的复制。,（,4,）分子量小，拷贝数多。,（,5,）容易从宿主细胞中分离纯化。,常用的载体有,5,类：,3.,载体的种类,质粒（,plasmid,）,单链,DNA,噬菌体,M13,噬菌体的衍生物,柯斯质粒（,cosmid,）,动物病毒（,virus,）,基因组文库载体,P1,噬菌体载体,cosmid,黏粒载体,BAC,载体（细菌人工染色体）,PAC,载体（,P1,人工染色体）,YAC,载体（酵母人工染色体）,各种载体的比较,载体,容量（,kb,）,宿主,导入细胞方式,黏粒,30-45,大肠杆菌,转导,P1,70-100,大肠杆菌,转导,PAC,130-150,大肠杆菌,电转,BAC,120-300,大肠杆菌,电转,YAC,250-400,酵母,转化,基因组,DNA,文库需要包含足够多的克隆，来保证文库的代表性,。,N=,ln,(1-P)/,ln,(1-f),P,是希望得到的覆盖率，,f,是插入片段大小与基因组,DNA,大小的比值，,N,是所需的克隆数。,举例来说，,用,BAC,载体构建人类基因组文库，,人类基因组大小为,3 x 10,9,bp,插入片段大小为,100kb,，,希望覆盖率,99%,，那么所需要的,BAC,克隆数为,N=,ln,(1-0.99)/,ln,(1-10,6,bp/3 x 10,9,bp,),=-4.61/-3.33 x 10,-6,=138,298,文库克隆数的确定,基因组文库构建的基本流程,：,基因组,DNA,片段的制备,载体的制备,将基因组,DNA,片段连接入载体,将重组载体转入宿主细胞。,1,载体,DNA,片段的制备,载体,DNA,分离纯化 限制酶切 脱磷酸化反应,2,外源,DNA,片段的制备,总,DNA,分离纯化 分离特定大小,DNA,片段,机械剪切法,酶法 部分酶切,完全酶切,3.,供体与载体,DNA,连接,要提高重组频率，应注意连接反应体系中的总,DNA,浓度和两种,DNA,分,子的分子比率。,4.,重组,DNA,分子的转移和基因组文库的扩增,利用转化或感染方法将连接,DNA,分子导入宿主细胞，让其自主复,制，重组,DNA,分子被扩增（重组子比率可能发生变化）,5.,基因组文库质量的评价,1,）文库规模,-,随机挑取一些重组子，提取质粒,DNA,，电泳测定插入片段大小，然后根据上述公式计算文库大小。,2,）重组频率,-,频率越高，质量越高，可大大减轻后续筛选基因工作量。,Fosmid,library,BAC library,Experiment,小片段基因组文库的构建,片段的来源,根据实验要求选择片段的大小；,酶切产物直接回收（酶的使用与载体要一致）,酶切产物,PCR,扩增（,T,载体）,载体的选择,质粒载体,考虑因素,pMD-18T vector 0.5,l,solution 5.0,l,insert DNA fragment 4.5,l,(AFLP,预扩增产物）,连接,16,连接,8h,10l,连接产物加入到,100,l,感受态细胞悬液中，轻轻旋转以混匀内容物，在冰上放置,30min,。,将管放到预加温到,42,的循环水浴中，恰恰放置,90s,，不要摇动。,快速将,EP,管转移到冰浴中，使细胞冷却,1-2min,。,每管加,400,l,LB,培养基，然后放于,37,摇床上，,30min,，使细胞复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。,在加有氨苄的固体,LB,培养基平板上涂,40,l,X-gal,和,4,l,IPTG,取,250,l,已转化的感受态细胞涂到已处理的平板上涂板均匀。,将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平皿，于,37,培养，,12-16h,后可出现菌落。,转化,用牙签挑取白色菌落到加有,4ml LB,培养液（含有,0.1%,氨苄）中，在,37,摇床中摇,10h,。,挑菌,插入片段大小检测,质粒酶切,将已摇好的菌液加入,1.5ml,离心管中,10000rpm 30s,离心，去除上清液，重复一次，用移液器将残留的培养液吸出；,在,离心,管中加入,150l,Solution,（,50mM,葡萄糖，,25mMTris-HCl,10mMEDTA),用,移液器,吹打使沉淀悬浮。,新鲜配制,Solution,（,0.2MNaOH,1%SDS),加,300,l Solution,到上述管中，缓慢颠倒混匀，冰浴,5min,。,加,225,l Solution,（,5M KAC,，冰乙酸）到上述管中，混匀，冰浴,5min,以,10000rpm,离心,5min,，取上清于新的,EP,管中，加等体积氯仿，颠倒混匀，,12000rpm,离心,5min,取上清，加入,2/3,体积异丙醇，颠倒混匀后在,-20,下放置,10min,，,10000rpm,离心,5min,，去上清,用,75%,乙醇洗沉淀,1,次后，在超净工作台中吹干，加,10,l ddH2O,溶解,.,Plasmid 10,l,10H buffer 2,l,Eco,R I 1.0,l,Pst,I 1.0,l,RNase,0.5,l,H,2,O 5.5l,37,C,酶切过夜，,0.8%,琼脂糖电泳检测,思考题,1,影响文库连接效率的因素包括哪些？,文库质量检测包括哪些方面？,质粒提取中过程中溶液,I,溶液,II,溶液,III,的作用分别是什么？,