第四章 灭菌与空气净化.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,灭菌与空气净化,第四章,灭菌与空气净化,第一节,灭菌,第二节,空气净化,第一节 灭菌,一、常见灭菌方法,灭菌是指利用物理或化学方法杀灭或除去物料及设备中一切生命物质的过程，比消毒的要求更加严格。在发酵工业生产中，为保证纯种培养，在接种之前，要对培养基、空气系统、补料或流加系统、设备和管道等进行灭菌，还要对生产环境进行消毒，防止杂菌或噬菌体的大量繁殖。常用的灭菌方法有以下几种：,1化学灭菌,一些化学药剂能与微生物的细胞发生反应而具有杀菌的作用。常用的化学药剂有甲醛、氯（或次氯酸钠）、高锰酸钾、环氧乙烷、季铵盐（或新洁尔灭）、臭氧等。由于化学药剂也会与培养基中的一些成分作用，而且加入培养基后不易去除，所以化学灭菌法一般不用于培养基的灭菌，适用于车间环境的灭菌，接种操作前小型器具的灭菌等。,第一节 灭菌,化学药剂的使用，根据灭菌对象的不同有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸等。,2射线灭菌,射线灭菌就是利用紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的,射线等进行灭菌的方法，以紫外线最为常用。紫外线对芽孢和营养细胞都能起作用，但细菌芽孢和霉菌孢子对紫外线的抵抗力较强。紫外线的穿透力较低，仅适用于表面灭菌和无菌室、培养室等空间的灭菌，对固体物料灭菌不彻底，也不能用于液体物料的灭菌。250270,nm,之间杀菌效率高，以波长在260,nm,左右杀菌效率最高。除紫外线外，也可利用0.614,nm,的,X,射线或由,Co,60,产生的,射线进行灭菌。今年来，微波灭菌设备的兴起，为灭菌提供了新的选择。,第一节 灭菌,3干热灭菌,干热灭菌是指利用高温，导致微生物细胞发生氧化，微生物体内蛋白质发生变性和电解质浓缩引起中毒等作用，氧化作用导致微生物死亡是主要依据。由于微生物对干热的耐受能力比对湿热强得多，所以干热灭菌与湿热相比所需的温度要高，时间要更长，一般为160170，11.5,h。,实际应用时，对一些要求保持干燥的实验器具和材料（如培养皿、接种针、固定化细胞用的载体等）可以用干热灭菌。,第一节 灭菌,4湿热灭菌,湿热灭菌就是指利用饱和水蒸汽进行灭菌。由于蒸汽具有很强的穿透能力，而且在冷凝时能释放出大量的热能，易使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆转的变性，导致微生物死亡。其灭菌效果远远好于干热灭菌。同时，蒸汽的价格便宜，来源方便，灭菌效果可靠，是目前最常用的灭菌方法。一般的湿热灭菌条件是121，30,min。,第一节 灭菌,5过滤除菌,过滤除菌就是利用过滤方法截留微生物，达到除菌的目的。此法只适用于澄清流体和气体的除菌。工业上常用过滤除菌方法大量制备无菌空气，供好氧微生物的深层培养适用。对于热敏性培养基也采用过滤方法实验除菌。在产品过程中，也可利用无菌过滤方法来处理料液，以获得无菌产品。,以上的一些灭菌方法，有时也可根据需要结合适用。如动物细胞了离体培养的培养基中通常含有血清、多种氨基酸、维生素等热敏性物质，在制备这类培养基时，可将其中的热敏性溶液用无菌过滤的方法除菌，其他物质的溶液则用湿热灭菌，也可将热敏性物质在较低温度或较短时间内灭菌，再与其他部分合并使用。,第一节 灭菌,二、培养基的灭菌,由于培养基的灭菌大多数采用湿热方法灭菌，所以这里介绍培养基的湿热灭菌。,1微生物的死亡速率与理论灭菌时间,（1）微生物的热阻 每一种微生物都有一定的最适生长温度范围，存在一个最低限和最高限，当微生物处于最低限温度以下时，处于休眠状态。而当温度高于最高限，细胞的蛋白质就易发生凝固变性，导致微生物在短时间内死亡。一般无芽孢的细菌，在60下10,min,即可全部杀死。而芽孢细菌的芽孢能经受较高的温度，在100下要经过数分钟甚至数小时才能杀死。某些嗜热菌芽孢能在120下耐受2030,min，,但这种菌在培养基中出现的机率较低。一般认为灭菌的彻底与否以能否杀死芽孢细菌为标准。,第一节 灭菌,杀死微生物的极限温度称致死温度。在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间称为致死时间。在致死温度以上，温度越高，致死时间越短。由于一般细胞、芽孢细菌、微生物细胞和微生物孢子，对热的抵抗力不同，因此它们的致死温度和致死时间也有差别。微生物对热的抵抗能力通常用,“,热阻,”,表示。热阻是指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。相对热阻是指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值，表4-1是几种微生物对湿热的相对抵抗力。可见，细菌的芽孢比大肠杆菌对湿热抵抗力约高3000000倍。,第一节 灭菌,（2）微生物的热死规律,对数残留定律 微生物热死是指微生物受热失活直到死亡。微生物受热死亡主要是由微生物细胞内酶蛋白受热凝固变性所致。在一定温度下，微生物受热后其死亡细胞的个数的变化如化学反应的浓度变化一样，遵循一定的规律。在微生物受热失活的过程中，微生物不断被杀死，活细胞不断减少。,表4-1 微生物对湿热的相对抵抗力,微生物名称,大肠杆菌,细菌芽孢,霉菌孢子,病 毒,相对抵抗力,1,3000000,210,15,第一节 灭菌,因此，微生物受热死亡的速率与微生物存活细胞数目有关，即微生物受热死亡的速率与任一瞬间残存的微生物活细胞数成正比：,（4-1）,式中,N,培养基中残存的活细胞数,t,受热时间，,min,k,反应速率常数，又称比死亡速率常数，,min,-1,第一节 灭菌,若开始灭菌时（,t=0），,培养基中活微生物数为,N,0,，,经过,t,时间后活微生物数变成,N,t,，,将式（4-1）积分得到：,（4-2）,或 （4-3）,式（4-3）称为对数残留定律，可以根据残留菌数,N,t,的要求计算所需的灭菌时间,t。,将存活率,N,t,/N,0,对时间,t,在半对数坐标上绘图，可得到一条直线，其斜率的绝对值就是比死亡速率常数,k。,图4-1是大肠杆菌在不同温度下的残留曲线，可以看出温度越高，,k,值（斜率的绝对值）越大，微生物越容易死亡。,第一节 灭菌,某些微生物受热死亡的速率不完全符合对数残留定律，将存活率,N,t,/N,0,对时间,t,在半对数坐标上绘图，得到的不是直线（图4-2）。这主要是这类微生物中既存活着营养细胞，也存活着耐热的芽孢，但温度越高，,k,值（斜率的绝对值）越大，微生物越容易死亡这个规律不变。,第一节 灭菌,上述式中的反应速率常数,k,是微生物耐热性的一种特征，它随微生物的种类和灭菌温度的变化而变化。在相同的温度下，,k,值越小，则此微生物越耐热。一般情况下，微生物芽孢的,k,值远小于其营养细胞；不同细菌的芽孢的,k,值也不相同，表4-2是121下几种芽孢细菌的,k,值。同一种微生物在不同的灭菌温度下，,k,值也不同，灭菌温度越低，,k,值越小；温度越高，,k,值越大，微生物死亡的越快。如硬脂嗜热芽孢杆菌,FS1518,在104下,k,值为0.0342,min,-1,，121,时,k,值为0.77,min,-1,，,而131时,k,值则为15,min,-1,，,可见提高灭菌温度，,k,值增大，灭菌时间显著缩短。,第一节 灭菌,表4-2 121下几种芽孢细菌的,k,值,细菌名称,k,值/,min,-1,细菌名称,k,值/,min,-1,枯草芽孢杆菌,3.82.6,硬脂嗜热芽孢杆菌,FS617,2.9,硬脂嗜热芽孢杆菌,FS1518,0.77,产气梭状芽孢杆菌,PA3679,1.8,第一节 灭菌,随着时间的延长，加热后的残留菌数呈对数减少，且温度越高，死亡越快。但培养基灭菌时并不时始终符合对数残留定律，特别是在受热后很短的时间内，培养基中油脂、糖类及一定浓度的蛋白质会增加微生物的耐热性；高浓度盐类、色素能降低其耐热性。同时随着灭菌条件的加强，培养基的成分可能也会受到破坏，如糖溶液会焦化变色、蛋白质变性、维生素失活、醛糖与氨基化合物反应、不饱和醛聚合、一些化合物发生水解等。因此培养基的灭菌一般都采用高温短时间加热的方式，这样可以达到彻底灭菌和把营养成分的破坏减少到最低限度的目的。表4-3是不同灭菌条件下培养基营养成分的破坏情况。,第一节 灭菌,表4-3 不同灭菌条件下培养基营养成分的破坏情况,温度/,灭菌时间/,min,营养成分破坏/%,温度/,灭菌时间/,min,营养成分破坏/%,100,400,99.3,130,0.5,8,110,30,67,140,0.08,2,115,15,50,150,0.01,1,120,4,27,第一节 灭菌,从式（4-3）可得：,或 （4-4）,从式（4-4）可见，灭菌时间取决于培养基中所含的原始微生物数（,N,0,），,灭菌的程度（,N,t,）,和,k,值。在培养基中有各种各样的微生物，不可能逐一加以考虑。如果将全部微生物作为耐热的细菌芽孢来考虑，虽然会延长灭菌时间或提高灭菌温度，但灭菌效果得到了保证。,另一个问题是灭菌的程度，如果要达到彻底灭菌，即,N,t,=0，,则,t,要为，实际操作中这显然不可能。因此，在设计时常采用,N,t,=0.001（,即灭菌1000次有一次失败的机会）,最后要注意的是通过式（4-4）计算得到的是理论灭菌时间，实际的设计和操作时可做适当的延长或缩短。,第一节 灭菌,2培养基的分批灭菌,培养基的分批灭菌就是指将配制好的培养基放在发酵罐或其他容器中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起灭菌的操作过程，也称实罐灭菌。在实验室，由于培养基量较少而采用的灭菌锅灭菌也是分批灭菌。在工业上，培养基的分批灭菌不需要专门的灭菌设备，设备投资少，灭菌效果可靠，对灭菌用蒸汽要求低（0.20.3,Mpa,表压），但因其灭菌温度低、时间长而对培养基成分破坏大，其操作难于实现自动控制。分批灭菌是中小型发酵罐经常采用的一种培养基灭菌方法。,第一节 灭菌,（1）分批灭菌的操作 分批灭菌在所用的发酵罐中进行。将培养基在配料罐中配制好，通过专用管道用泵输送到发酵罐，开始灭菌。图4-3是通用式发酵罐常见的管路配备。一般有空气管路和排气管路，取样用的取样管道，放料用的出料管道，接种管道，消沫剂管道，补料管道等。发酵罐传热用的夹套或蛇管，因采用间壁传热而与发酵罐内部不相通。,第一节 灭菌,在进行培养基灭菌之前，通常先把发酵罐的空气分过滤器灭菌并用空气吹干。进料完毕后，开动搅拌以防料液沉淀。然后开启夹套蒸汽阀，缓慢引进蒸汽，使料液预热升温至80左右后关闭夹套蒸汽阀门。开3路（空气、出料、取样）进汽阀，开排气阀，包括小辫子（进料管、补料管、接种管排气阀）。当升温至110左右，控制进出汽阀门直至121（表压0.,lMPa,）,开始保温，保温一般为30,min。,保温结束后，关闭过滤器排气阀、排汽阀、进汽阀。关闭夹套下水道阀，开启冷却水进回水阀。待罐压低于过滤器压力时，开启空气进气阀引入无菌空气。随后引人冷却水，将培养基温度降至培养温度。,第一节 灭菌,（2）分批灭菌的计算 分批灭菌的过程包括升温、保温和降温三个阶段，如图4-4所示。灭菌主要是在保温过程中实现，在升温段后期，也有一定的灭菌作用。,第一节 灭菌,培养基的升温，可以在夹套或蛇管内通入蒸汽间壁加热，也可直接将蒸汽通人培养基中，或兼用。但直接通蒸汽会因冷凝水的加入改变培养基的消后体积。,培养基的保温阶段，是灭菌的主要时段。习惯上，把保温时间看为灭菌时间。,降温是培养基灭菌后用冷却水间壁将培养基冷却至培养所要求温度的过程。随着发酵罐容积的加大，分批灭菌的升温和降温时间就延长，由此造成培养基成分的破坏。同时，发酵罐的设备利用率也有所降低。,分批灭菌中，如果不计升温阶段所杀灭的菌数，把培养基中所有的菌都看作是在保温阶段（灭菌温度）被杀灭，这样可以简单的利用式（4-4）粗略计算灭菌所需要的时间。,第一节 灭菌,例4-1 有一发酵罐内装40,m,3,培养基，在121温度下进行实罐灭菌。原污染程度为每1,ml,有2,10,5,个耐热细菌芽孢，121时灭菌速度常数为1.8,min,-1,。,求灭菌失败机率为0.001时所需要的灭菌时间。,解,N,o,=40,10,6,2,10,5,=8,10,12,（,个）,N,t,=0.001（,个）,k=1.8（min,-1,）,灭菌时间：（,min）,但是实际上，培养基在加热升温时（即升温阶段）就有部分被杀灭，特别是当培养基加热至100以上，这个作用较为显著。因此，保温灭菌时间实际上比上述计算的时间要短。严格地讲，在降温阶段也有杀菌作用，但降温时间较短，在计算时一般不考虑。,第一节 灭菌,在升温阶段，培养基温度不断升高，菌死亡速率常数也不断增大，反应速率常数与温度有一定关系。,（4-5）,式中,A,为系数，,S,-1,；E,为活化能，,J/mol；R,为气体常数，8.314,J/（mol,K）；T,为绝对温度，,K,上式也可改写成,（4-6）,当以某耐热杆菌的芽孢为灭菌对象时，此时,A=1.34,10,36,S,-1,，E=2.84,10,4,J/mol，,因此，式（4-6）可写成,（4-7）,利用式（4-7）可以求得不同温度下的反应速率常数。,第一节 灭菌,考虑到升温阶段对灭菌的贡献，实际上保温开始时培养基中活微生物数不是,N,0,，,而是,N,p,，,得：,(4-8),式中,t,p,为升温阶段时间，可从100开始算起，可从经验值或通过热量恒算取得该数值。,k,m,为这一温度段内的灭菌常数之平均值,(4-9),式（4-9）中的积分可以通过图解积分法求得。,第一节 灭菌,例4-2 在例4-1中，灭菌过程的升温阶段，培养基从100上升到121，共需15,min。,求升温阶段结束时，培养基中芽孢数和保温所需时间。,解,T,1,=273+100=373K,T,2,=273+121=394K,先通过式（4-7）求得不同温度下的,k,值，再用图解积分法求得,S,-1,培养基中芽孢数为 （个）,保温所需时间为,min,第一节 灭菌,由此可见，考虑升温段的灭菌作用后，保温时间比不考虑减少了15%。所以发酵罐体积越大，其分批灭菌的升温时间长，就更应该考虑升温段的灭菌作用，其保温时间应该更短。,3培养基的连续灭菌,培养基分批灭菌的显著缺点是对培养基成分破坏大、升降温时间长，尤其是在发酵罐体积越来越大的今天，其在高温下持续的时间更长，其培养基成分遭受破坏也越严重。而以,“,高温、快速,”,为特点的连续灭菌，就是将配制好的培养基再通入发酵罐时进行加热、保温、降温的灭菌过程，也称为连消。图4-5是连续灭菌的设备流程图。连续灭菌时，培养基在短时间内被加热到灭菌温度（一般高于分批灭菌温度，130160），短时间保温（一般为58,min）,后，被快速冷却，再进入早已灭菌完毕的发酵罐。,第一节 灭菌,第一节 灭菌,培养基采用连续灭菌时，发酵罐应再连续灭菌开始前先进行空罐灭菌（空罐灭菌的方法基本和分批灭菌相同）。加热器、维持罐及冷却器也应事先灭菌。组成培养基的不同成分（耐热与不耐热、糖与氮源）可再不同温度下分开灭菌，以减少培养基受热破坏的程度。,培养基的连续灭菌具有对培养基破坏小、可以实现自动控制、提高发酵罐的设备利用率、蒸汽用量平稳等优点而被广泛应用，尤其在培养基体积较大时。但对加热蒸汽的压力要求较高，一般不小于0.45,MPa,。,同时连续灭菌需要一组附加设备，设备投资大。,连续灭菌时，配料罐用于培养基的配制。然后将培养基用泵打入预热桶中。,第一节 灭菌,预热桶的作用是定容与预热。预热的目的是使培养基在后续的加热过程中能迅速升温到指定的灭菌温度，同时可避免太多的冷凝水带入培养基，还可减少震动和噪声。一般可以将培养基预热到7090。,预热好的培养基由连消泵打入加热器。加热器又称连消塔，使培养基与蒸汽混合并迅速达到灭菌温度。加热采用的蒸汽压力一般为0.450.8,Mpa,，,其目的是使培养基在较短的时间（2060,s）,里快速升温。加热器常用的有塔式和喷射式两种。,第一节 灭菌,加热后通过保温将培养基维持灭菌温度一段时间，这是杀灭微生物的主要过程。其设备有维持罐和管式维持器两种。保温设备一般用保温材料包裹，但不直接通入蒸汽。管式维持器的优是管的直径较小，物料可一直沿管子向前流动，先进先出，不会返混；而维持罐由于直径远大于进料管，培养基在罐内混合，不能作到先进先出，返混现象严重，因而延长了保温时间。,保温结束以后，必须迅速降温至接近培养温度（4045），避免培养基营养成分的破坏。国内大多数采用喷淋冷却器，也有采用螺旋版换热器、板式换热器、真空冷却器等。,第一节 灭菌,连续灭菌的理论灭菌时间计算可沿用对数残留定律，如忽略升温的灭菌作用，保温时间为,或 （4-10）,式中,C,0,、C,t,分别式单位体积培养基在灭菌前后的或菌数，个/,ml,例4-3 若将例4-1中的培养基采用连续灭菌，灭菌温度为131，求灭菌所需的维持时间。,解,k=0.237 s,-1,=14.23 min,-1,C,0,=2,10,5,个/,ml,C,t,=0.001/（40,10,6,）=2.5,10,-11,个/,ml,min,第一节 灭菌,可见，灭菌温度升高10后采用连续灭菌则保温时间大为缩短。,如果采用维持罐保温的还必须考虑返混的情况，为确保灭菌效果，实际维持时间常取理论灭菌时间的35倍。,4影响培养基灭菌的因素,影响培养基灭菌的因素除了所污染杂菌的种类、数量、灭菌温度和时间外，培养基成分、,pH,值、培养基中颗粒、泡沫等对培养基灭菌也有影响。,（1）培养基成分 油脂、糖类及一定浓度的蛋白质增加微生物的耐热性，高浓度有机物会包于细胞的周围形成一层薄膜，影响热的传递，因此在固形物含量高的情况下，灭菌温度可高些。例如，大肠杆菌在水中加热6065便死亡；在10糖液中，需7046,min；,在30糖液中需70 30,min。,第一节 灭菌,低质量分数(12)的,NaCl,溶液对微生物有保护作用，随着质量分数的增加，保护作用减弱，当质量分数达810以上则减弱微生物的耐热性。,（2）,pH,值,pH,值对微生物的耐热性影响很大。,pH,值6.08.0，微生物最耐热；,pH6.0，,氢离子易渗入微生物细胞内，从而改变细胞的生理反应促使其死亡。所以培养基,pH,值愈低，灭菌所需的时间愈短，见表4-4。,第一节 灭菌,表4-4,pH,值对灭菌时间的影响,温度/,孢子数/（个/,ml）,灭菌时间/,min,pH,值6.1,pH,值5.3,pH,值5.0,pH,值4.7,pH,值4.5,120,10000,8,7,5,3,3,115,10000,25,25,12,13,13,110,10000,70,65,35,30,24,100,10000,740,720,180,150,150,第一节 灭菌,（3）培养基中的颗粒 培养基中的颗粒小，灭菌容易，颗粒大，灭菌难。一般含有小于,lmm,的颗粒对培养基灭菌影响不大，但颗粒大时，影响灭菌效果，应过滤除去。,（4）泡沫 培养基的泡沫对灭菌极为不利，因为泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，热难以穿透，难以杀灭微生物。对易产生泡沫的培养基在灭菌时，可加入少量消泡剂。对有泡沫的培养基进行连续灭菌时更应注意。,第一节 灭菌,5分批灭菌和连续灭菌比较,连续灭菌与分批灭菌比较有很多优点尤其式生产规模大时，优点更为显著。主要体现在以下几方面：可采用高温短时灭菌，培养基受热时间短，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率；发酵罐利用率高；蒸汽负荷均匀；采用板式换热器时，可节约大量能量；适宜采用自动控制，劳动强度小。,但当培养基中含有固体颗粒或培养基中有较多泡沫时，以采用分批灭菌为好，因为在这种情况下用连续灭菌容易导致灭菌不彻底。对于容积小的发酵罐，连续灭菌的优点不明显，而采用分批灭菌比较方便。,第一节 灭菌,三、培养基与设备、管道灭菌条件,（1）,杀菌锅内灭菌 固体培养基灭菌蒸汽压力0.098,MPa,，,维持2030,min；,液体培养基灭菌蒸汽压力0.098,MPa,，,维持1520,min；,玻璃器皿及用具灭菌，压力0.098,MPa,，3060min。,（2）,种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐灭菌及管道灭菌 从有关管道通入蒸汽，使罐内蒸汽压力达0.147,MPa,，,维持45,min，,灭菌过程从阀门、边阀排出空气，并使蒸汽通过达到死角灭菌。灭菌完毕，关闭蒸汽后，待罐内压力低于空气过滤器压力时，通入无菌空气保持罐压0098,MPa,。,第一节 灭菌,（3）空气总过滤器和分过滤器灭菌 排出过滤器中的空气，从过滤器上部通人蒸汽，并从上、下排气口排气，维持压力0.174,MPa,灭菌2,h。,灭菌完毕，通人压缩空气吹干。,（4）种子培养基实罐灭菌 从夹层通入蒸汽间接加热至80，再从取样管、进风管、接种管进蒸汽，进行直接加热，同时关闭夹层蒸汽进口阀门，升温至121，维持30,min。,谷氨酸发酵的种子培养基实罐灭菌为110，维持,l0min。,第一节 灭菌,第,（5）发酵培养基实罐实菌 从夹层或盘管进入蒸汽，间接加热至90，关闭夹层蒸汽，从取样管、进风管、放料管三路进蒸汽，直接加热至121，维持30,min。,谷氨酸发酵培养基实罐灭菌为105，维持5,min。,（6）,发酵培养基连续灭菌 一般培养基为130，维持5,min，,谷氨酸发酵培养基为115 68,min。,（7）,消泡剂灭菌 直接加热至121，维持30,min。,（8）,补料实罐灭菌根据料液不同而异。淀粉料液为121，维持5,min。,（9）,尿素溶液灭菌 105，维持5,min。,第二节 空气净化,大多数微生物为好氧微生物，在培养时需要提供氧气，最常用的氧源就是空气。而空气中除了含有氧气外，还含有其他多种成分，其中有一些是不能进入培养系统的，因此必须对空气进行净化。,一、空气的除菌,空气是气态物质的混合物，主要成分为氮气和氧气，还含有惰性气体、二氧化碳或水蒸气等。此外，在空气中悬浮有很多灰尘，主要是由无机物微粒、烟灰、花粉和种类繁多的微生物所组成。空气中常见的微生物主要是细菌、酵母菌、霉菌和病毒。,第二节 空气净化,第,空气中微生物的数量和环境有着密切的关系。一般干燥寒冷的北方，空气中含微生物较少，而潮湿温暖的南方空气中含微生物较多，城市空气中的微生物比人口稀少的农村多，地平面空气中的微生物比高空中多。工程设计中常以微生物浓度10,4,个/,m,3,作为空气的污染指标。,1发酵用无菌空气的质量标准,发酵用的无菌空气，就是将自然界的空气经过压缩、冷却、减湿、过滤等过程，达到以下标准：连续提供一定流量的压缩空气。发酵用无菌空气的设计和操作中常以通气比或,VVM,来计算空气的用量。,VVM,的意义是单位时间（,min）,单位体积（,m,3,）,培养基中通入标准状况下的空气的体积（,m,3,），,一般为0.12.0。,第二节 空气净化,空气的压强（表压）为0.20.4,Mpa,。,压强过低不利于克服发酵罐中的下游阻力，压强过高则不必要。进入过滤器之前，空气的相对湿度,70%。,这是为了防止空气过滤介质的受潮。进入发酵罐的空气温度可比培养温度高1030。虽然对于发酵而言，空气的温度低较好，但太低的温度需要消耗过多的能量。压缩空气的洁净度，在设计空气过滤器时，一般取失败概率为10,-3,为指标。也可以把100级作为无菌空气的洁净指标。100级指每立方米空气中，尘埃粒子数最大允许值0.5,m,的为3500，5,m,的为0；微生物最大允许数为5个浮游菌/,m,3,，1,个沉降菌/,m,3,。,第二节 空气净化,2,空气预处理,第二节 空气净化,第,图4-6是空气设备净化系统流程图。一般我们把这个流程中空气过滤器以前的部分称为空气预处理阶段。在预处理阶段的设备简单介绍如下：,（1）采风塔 采风塔应建在工厂的上风处，远离烟囱。采风塔可采用铁皮或混凝土建造，要求越高越好，至少10,m，,设计的气体流速在8,m/s,左右。有时可把采风塔建成采风室，直接建在空压机房上面，以节省地方和利用空间。,第二节 空气净化,（2）,粗过滤器 粗过滤器安装在空压机吸入口前，又称前置过滤器。其主要作用是拦截空气中较大的灰尘以保护空气压缩机，同时也起到一定的除菌作用，减轻总过滤器的负担。粗过滤器应具有阻力小、灰尘容量大的特点，否则会成为阻力而影响压缩机吸气。过滤介质可采用泡沫塑料（平板式）或者无纺布（折叠式），设计流速为0.10.5,m/s。,（3）,空气压缩机 空气压缩机的作用是提供动力，以克服随后的各个设备的阻力。目前国内常用的空压机有往复式空压机、螺杆式和涡轮式空压机。空压机的选用应根据空气用量、结合本地实际及空压机的特点合理使用。为保证连续供气，一般不提倡单台空压机。,第二节 空气净化,第,（4）,空气贮罐 空气贮罐的作用是消除空气压缩机的脉动，这对于往复式空压机特别重要。如果选用螺杆式或涡轮式空压机，由于其排气是均匀而连续的，则压缩空气贮罐可以省去。,（5）冷却器 空压机出口温度一般在120左右，必须冷却。另外在潮湿季节或地区，空气中含水量较高，为避免过滤介质受潮而失效，冷却还可以达到除湿的目的。,空气冷却器可采用列管式换热器，空气走壳程，管内走冷却水。一般中小型工厂采用两级空气冷却器串联来冷却压缩空气。在夏天第一级冷却器可用循环水来冷却空气，第二级冷却器要采用9左右的低温水来冷却压缩空气。由于空气被冷到露点以下会有凝结水析出，故冷却水的下部应设置排除凝结水的接管口。,第二节 空气净化,第,（6）,气液分离设备 冷却后的压缩空气，会有来自空压机的润滑油，尤其是往复式空压机。如果冷却温度低于露点，空气中还会有水。所以在冷却器后面安装了气液分离设备，除去空气中的油和水，以保护过滤介质。,用在这里的气液分离设备一般有两类，一是利用离心力沉降的旋风分离器，主要除去空气中绝大多数的20,m,的液滴；二是利用惯性拦截的介质分离器，如丝网除沫器，它可去除1,m,以上的雾滴，去除率约为98%。,第二节 空气净化,第,（7）,空气加热设备 压缩空气经过气液分离设备把夹带在空气中的液滴、雾沫除去后，其相对湿度仍为100%（如果冷却到露点以下）。在进入总过滤器之前为了把空气的相对湿度从100%降到70%以下，应该再将空气加热。,3空气的过滤除菌,各种不同的培养过程，鉴于其所用菌种的生长能力强弱、生长速度的快慢、培养周期的长短以及培养基的差异，对空气灭菌的要求也不相同。所以，对空气灭菌的要求应根据具体情况而定，但一般仍可按10,-3,的染菌概率考虑。空气净化的方法有热灭菌法、静电除菌、介质过滤除菌法。,第二节 空气净化,第,过滤除菌法，是让含菌空气通过过滤介质，以阻截空气中所有微生物，而取得无菌空气，按除菌机制不同，可分为绝对过滤和深层介质过滤两类。绝对过滤所用过滤介质的滤孔小于细胞和孢子，从而能将微生物阻留在介质的一侧，例如将多孔的聚乙烯醇缩甲醛树脂（,PVF）,经过热处理制成孔径小于0.3,m,的滤膜。悬浮于空气中的菌体大小一般为0.55,m，,因而这种材料有很好的除菌效果。纤维素、硅酸硼纤维、聚四氟乙烯等都可作为过滤介质。由于孔隙小于微生物，空气中即使有液滴也不会影响其除菌效果。为了使过滤介质有较长的使用寿命，要求空气在进行过滤前，先经过粗滤器除去较大的颗粒。该方法主要应用于医疗及特种发酵。,第二节 空气净化,第二节 空气净化,深层介质过滤所用介质的孔隙一般大于微生物细胞，为了达到所需的除菌效果，介质必须有一定的厚度。这种介质的除菌机理比较复杂，主要是依靠气流通过滤层时，基于滤层纤维网格的层层阻碍，迫使气体在流动过程中产生无数次改变气速大小和方向的绕流运动，而菌体微粒由于具有一定的质量，在以一定速度运动时具有惯性，碰到介质时，由于惯性作用而离开气流，在摩擦、粘附作用下被滞留在介质表面上，这种捕集微粒的作用叫做惯性撞击截留作用。目前工厂和实验室多采用深层介质过滤。,第二节 空气净化,深层过滤介质又分为两类，第一类过滤介质有棉花、玻璃纤维、合成纤维和颗粒状活性炭，图4-7是用这类介质填充的过滤器。第二类是将过滤材料做成纤维滤纸、金属烧结板等，图4-8是超细玻璃纤维纸过滤器，这些材料除菌效率高，无需填充得很厚，如果用超细纤维玻璃纸只需要少量几张就可以了。,在实验室或中试规模，空气过滤器只设一级，而大发酵工厂大多采用两级甚至三级过滤。第一级过滤器常称为总过滤器，二、三级过滤器称为分过滤器。,第二节 空气净化,过滤器在使用前，也需要进行灭菌，一般是使用蒸汽灭菌，灭菌后用压缩空气吹干。总过滤器约每月灭菌一次，为了使总过滤器不间断地进行工作，一般应有备用，以便在灭菌时替换使用。,二、空气净化流程,空气净化的一般流程是把吸气口吸入的空气先经过压缩前的过滤，再进入压缩机。从空压机出来的空气（一般高温高压），先冷却到适当的温度，并通过气液分离设备除去油和水，再加热到一定温度，最后通过总过滤器和分过滤器除菌，从而获得洁净度、压力、温度和流量都符合要求的无菌空气。,第二节 空气净化,第,具有一定压力的无菌空气可以克服空气在预处理、过滤除菌及有关设备、管道、阀门、过滤介质等的压力损失，并在培养过程中能维持一定的罐压。因此过滤除菌的流程必须有供气设备,空气压缩机，对空气提供足够能量，同时还要具有高效的过滤除菌设备以除去空气中的微生物颗粒。对于其他附属设备则要求尽量采用新技术以提高效率，精简设备流程，降低设备投资、运转费用和动力消耗，并简化操作。但流程的制订要根据具体所在地的地理、气候环境和设备条件来考虑。如在环境污染比较严重的地方要改变吸风的条件（如采用高空吸风），以降低过滤器的负荷，提高空气的无菌程度；而在温暖潮湿的地方则要加强除水设施以确保和发挥过滤器的最大除菌效率。,第二节 空气净化,要保持过滤器在比较高的效率下进行过滤，并维持一定的气流速度和不受油、水的干扰，则要有一系列的加热、冷却及分离和除杂设备来保证。空气净化的一般流程如下。,空气吸气口粗过滤器空气压缩机一级空气冷却器二级空气冷却器分水器空气贮罐旋风分离器丝网除沫器空气加热器总空气过滤器分空气过滤器无菌空气,空气过滤除菌有多种工艺流程，下面介绍几种较典型的流程。,第二节 空气净化,第,1两级冷却、加热除菌流程,图4-6即为两级冷却、加热除菌流程示意图。它是一个比较完善的空气除菌流程，可适应各种气候条件。它能充分地分离油水，使空气达到较低的相对湿度后进人过滤器，以提高过滤效率。该流程的特点是两次冷却、两次分离、适当加热。两次冷却、两次分离油水的好处是能提高传热系数，节约冷却用水，油水分离得比较完全。经第一冷却器冷却后，大部分的水、油都已结成较大的雾粒，且雾粒浓度较大，故适宜用旋风分离器分离。第二冷却器使空气进一步冷却后析出一部分较小雾粒，宜采用丝网分离器分离，这样发挥丝网能够分离较小直径的雾粒和分离效果高的作用。通常，第一级冷却到3035，第二级冷却到2025。除水后，空气的相对湿度仍是100%，须用丝网分离器后的加热器加热将空气中的相对湿度降低至50%60%，以保证过滤器的正常运行。,第二节 空气净化,第,两级冷却、加热除菌流程尤其适用于潮湿的地区，其他地区可根据当地的情况，对流程中的设备作适当的增减。,2冷热空气直接混合式空气除菌流程,图4-9为冷热空气直接混合式空气除菌流程示意。,第二节 空气净化,第,从流程图可以看出，压缩空气从贮罐出来后分成两部分，一部分进入冷却器，冷却到较低温度，经分离器分离水、油雾后与另一部分未处理过的高温压缩空气混合，此时混合空气已达到温度为3035，相对湿度为50%60%的要求，再进入过滤器过滤。该流程的特点是可省去第二冷却后的分离设备和空气再加热设备，流程比较简单，利用压缩空气来加热析水后的空气，冷却水用量少。该流程适用于中等湿含量地区，但不适合于空气湿含量高的地区。,第二节 空气净化,第,3,高效前置过滤空气除菌流程,图4-10为高效前置过滤空气除菌的流程示意图。它采用了高效率的前置过滤设备，利用压缩机的抽吸作用，使空气先经中、高效过滤后，再进入空气压缩机，这样就降低了主过滤器的负荷。经高效前置过滤后，空气的无菌程度已经相当高，再经冷却、分离，入主过滤器过滤，就可获得无菌程度很高的空气。此流程的特点是采用了高效率的前置过滤设备，使空气经多次过滤，因而所得的空气无菌程度很高。,第二节 空气净化,第二节 空气净化,4,利用热空气加热冷空气的流程,图4-11为利用热空气加热冷空气的流程示意。它利用压缩后的热空气和冷却后的冷空气进行热交换，使冷空气的温度升高，降低相对湿度。此流程对热能的利用比较合理，热交换器还可兼做贮气罐，但由于气-气换热的传热系数很小，加热面积要足够大才能满足要求。,第二节 空气净化,三、无菌检测及发酵废气废物的安全处理,1无菌检测,工业生产中，为明确责任、跟踪生产进程、及早发现染菌等问题，一般在菌种制备、发酵罐接种前后和培养过程种都按时采样、尽情无菌检测。对发酵液的无菌检测有三种方式：无菌试验、镜检、试剂盒检验。,无菌试验有肉汤培养法、双蝶法、斜面培养法等。肉汤法是直接用装有酚红肉汤的无菌试管取样，37培养，观察培养基颜色的变化，确定是否染菌。双蝶法是取样在双蝶培养基上划线，取样培养6,h,后反复划线，培养24,h,后观察有无菌落。斜面培养法是接种于斜面上，培养24,h,后观察有无菌落。,第二节 空气净化,镜检采用显微镜直接观察取样中有无杂菌，明显的优势是快速，但染菌初期或杂菌少时无法确定，一般与肉汤法配合使用。,试剂盒是近几年出现的快速、高效检测灭菌效果和染菌的新手段。,空气系统的无菌检测主要考察过滤器是否失效。过滤器失效的检测方法一是检测过滤器两侧的压降，压降大说明过滤介质被堵塞；二是用粒子计数器测定空气中的粒子数是否超标，有无达到洁净度要求。,第二节 空气净化,第,2,发酵废气废物的安全处理,发酵过程中，发酵罐不断排出废气，其中夹带部分发酵液和微生物。中小型试验发酵罐厂采用在排气口接装冷凝器的方法回流部分发酵液，以避免发酵液体积的大幅下降。大型发酵罐的排气处理一般接到车间外经沉积液体后从,“,烟囱,”,排出。当发生染菌事故后，尤其发生噬菌体污染后，废气中夹带的微生物一旦排向大气将成为新的污染源，所以必须将发酵尾气进行处理。,